一种秀珍菇RNA病毒检测引物组及检测方法

一种秀珍菇rna病毒检测引物组及检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种秀珍菇rna病毒检测方法，具体涉及一种秀珍菇rna病毒的检测引物组及检测方法，属于生物技术领域。


背景技术：

2.秀珍菇pleurotus pulmonarius是20世纪90年代由中国台湾等地发现将凤尾菇的采收时间适当提前，其风味异常鲜美，并经过品种选育和栽培工艺的改进而开发的新品种，1998年林俊仁先生从中国台湾引进，在福建省罗源县试种成功后，逐渐向全国推广。秀珍菇是高温型的菌类，并且其子实体朵形优美，口感俱佳，不仅营养价值高，还有较高的药用价值，深受人们的喜爱，在全国有很好的种植基础，特别是近年来其菇价一直较高，多地已掀起了种植秀珍菇的热潮。
3.然而高温季节出菇也容易受到病虫害等的侵染，给生产带来严重的威胁。其中病毒的入侵将给秀珍菇生产带来无法预测的影响：由于形态微小，肉眼看不到，同时其可以潜伏在菌丝中，只有在子实体出现畸形后才被发现，此时对产量和质量已造成不可挽回的损失。此外，病毒还可以通过垂直传播给下一代，影响菌种质量。感染病毒的秀珍菇，将使幼小子实体发黄，并产生畸形（图1），严重的使子实体发黄、萎蔫而绝收（图2）。因此，如何在早期鉴别菌丝体是否感染了病毒至关重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种秀珍菇rna病毒的检测引物组和检测方法。通过设计秀珍菇rna病毒基因的特异引物，建立秀珍菇rna病毒的分子检测方法，为方便、快速、有效地检测秀珍菇菌种及子实体是否携带病毒提供技术支撑。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明首先提供了一种秀珍菇rna病毒的检测引物组，所述检测引物组选自以下引物plp_vir1或引物plp_vir1：引物组plp_vir1：正向引物序列：5'-tttccgatcaggccaatgag-3'，反向引物序列：5'-ccgcagttccagccaaatag-3'；引物组plp_vir2：正向引物序列：5
’‑
ccaacgctttgtccgcattc-3’，反向引物序列：5
’‑
atgacgccatatccaagtcc-3’。
6.其次，本发明还提供了一种秀珍菇rna病毒的检测方法，首先提取待测秀珍菇样品的总rna，通过反转录成cdna，以反转录的cdna为模板，再以上述的检测引物组作为引物进行rt-pcr扩增，凝胶电泳检测扩增产物，并对电泳结果进行判断，确定待测秀珍菇样品是否携带rna病毒。
7.进一步的，上述一种秀珍菇rna病毒的检测方法具体包括以下步骤：
（1）提取待测秀珍菇样品的总rna；（2）将步骤（1）提取的秀珍菇总rna反转录成cdna；（3）以步骤（2）所得cdna为模板，建立秀珍菇rna病毒的rt-pcr检测；pcr扩增体系总体积25μl：cdna模板1.5～3μl，premix taq 12.5μl，10μmol/l正向引物1μl，10 μmol/l反向引物1μl，ddh2o 7.5～9μl ；pcr反应条件：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30 sec，72 ℃延伸45sec, 30～35个循环；72 ℃延伸10 min；（4）根据凝胶电泳检测的dna图谱，若用引物组plp_vir1扩增出563 bp的特异dna条带，或用引物组plp_vir2扩增出521 bp的特异dna条带，则表示待测秀珍菇样品携带rna病毒，若采用引物组plp_vir1和引物组plp_vir2均未扩增出特异dna条带，则表示待测秀珍菇样品不携带rna病毒。
8.本发明的有益效果在于：本发明所提供的秀珍菇rna病毒检测方法，与电镜检测病毒、dsrna检测病毒和酶联免疫吸附法病毒等方法相比，具有灵敏度高、检测时间短、检测结果可靠、容易判断、重复性好的优点，具体如下：1、电镜检测病毒，此法最经典、最有效、最可靠等优点，但存在病毒粒子分离难、需要昂贵设备等不利于在普通实验室的快速检测。
9.2、dsrna检测技术，该方法是基于病毒为双链rna建立的检测技术，首先需要提取dsrna，然后再用双酶切进行检测，该方法具有成本低、快速、准确等优点，一度成为真菌病毒检测的常用方法，但该方法易受到提取过程试剂残留的干扰，以及酶切条带比较模糊等缺点，不利于直观快速判断。
10.3、酶联免疫吸附法检测病毒，虽然该方法具有灵敏度较高、特异性较好等优点，但当提取的病毒浓度较低时，特异性等就比较差，应用时存在一定的局限性。
11.4、还有生物芯片等技术检测病毒，但生物芯片法存在检测成本较高、操作较复杂等不利因素。
12.5、本发明所提供的以秀珍菇rna病毒基因组建立的rt-pcr检测方法，检测时间较短、灵敏度高、检测结果可靠、容易判断、重复性好等优点。基因是遗传的物质基础，不易受外界因素等的影响，同时得到的检测图谱具有特异性条带：563 bp 或521bp，其显性标记判断一目了然。
13.本发明可检测秀珍菇的菌种和子实体是否携带rna病毒，菌种是生产的基础，菌种质量的好坏关系到种植的成败，本发明对秀珍菇菌种rna病毒的检测，可避免在生产和科研上使用带rna病毒的菌种，保证用种安全；对秀珍菇子实体rna病毒的检测，可判断菌种或是间接判断环境中是否存在能感染秀珍菇的rna病毒；此外，本发明对秀珍菇菌种脱毒技术的建立、秀珍菇无病毒品种培育等方面有较大的应用价值。
附图说明
14.图1为秀珍菇幼小子实体感染病毒，表现出子实体发黄、部分畸形，同时菌丝活力较弱，出现霉菌感染。
15.图2为秀珍菇成熟子实体感染病毒，较多子实体出现发黄、子实体较软，影响品质
和商品外观。
16.图3为秀珍菇子实体rna病毒检测，泳道1～4采用的引物组为plp_vir1，标记片段大小为563 bp，表示含有rna病毒，其中泳道1和2是
‘
金秀’子实体样品，泳道3和4是
‘
秀57’子实体样品；泳道5～8采用的引物组为plp_vir2，标记片段大小为521 bp，表示含有rna病毒，其中泳道5和6是
‘
金秀’子实体样品，泳道7和8是
‘
秀57’子实体样品；m表示分量为dl 1000的dna mark，ck为空白对照。
17.图4为秀珍菇菌丝rna病毒检测，泳道9和11采用的引物组为plp_vir1，标记片段大小为563 bp，表示含有rna病毒；泳道10和12采用的引物组为plp_vir2，标记片段大小为521 bp，表示含有rna病毒；泳道9和10为
‘
金秀’的菌丝样品，泳道11和12是
‘
秀57’的菌丝样品，m表示分量为dl 2000的dna mark。
具体实施方式
18.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
19.实施例1：秀珍菇rna病毒分子检测引物的设计切取感染rna病毒的秀珍菇子实体0.1～0.2g，应用rna提取试剂盒（omega的试剂盒，产品号：plant rna kit r6827）提取总rna，具体操作步骤依据产品说明书；提取的rna经浓度和完整性检测后放-80℃保存备用，之后送北京诺禾致源科技股份有限公司进行二代测序，测序数据量为3～4g的干净数据（clean data），对这些基因组数据进行生物信息分析，从clean data中提取病毒相关的数据，并进行初步组装，对组装的序列应用primer5或其它引物设计软件设计rna病毒特异的引物，得到秀珍菇rna病毒的检测引物组，该检测引物组的特点是对秀珍菇rna病毒基因有特异扩增位点，得到的片段大小为563 bp 或521bp，而对秀珍菇的rna无扩增效果。所设计的秀珍菇rna病毒的检测引物组选自以下引物组plp_vir1或引物组plp_vir2：引物组plp_vir1：正向引物序列：5'-tttccgatcaggccaatgag-3'，反向引物序列：5'-ccgcagttccagccaaatag-3'；引物组plp_vir2：正向引物序列：5
’‑
ccaacgctttgtccgcattc-3’，反向引物序列：5
’‑
atgacgccatatccaagtcc-3’。
20.实施例2：秀珍菇子实体rna病毒分子检测（1）秀珍菇子实体总rna提取秀珍菇厂提供的
‘
金秀’和
‘
秀57’两个品种子实体，取子实体0.08～0.15g，应用omega的rna提取试剂盒（产品号：plant rna kit r6827）提取总rna，具体操作步骤依据产品说明书。提取的rna放-80℃保存备用或直接进行反转录，若放-80℃不超过7d。
21.（2）rna的反转录提取的rna应用反转录试剂盒（可用北京全氏金生物公司的反转录试剂盒，产品号：at311，或湖南艾科瑞生物工程有限公司的反转录试剂盒，产品号：ag11603）反转录成
cdna，具体操作步骤依据产品说明书。转录好的cdna放-20℃保存备用或直接进行pcr检测。
22.（3）秀珍菇子实体rna病毒特异性分子检测pcr扩增反应体系：cdna模板2μl，12.5μl premix taq（含染料），10μmol/l正向引物1μl，10μmol/l反向引物1μl，ddh2o 8.5 μl；pcr扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸45 sec, 35个循环；72℃延伸10 min。
23.（4）pcr产物的电泳检测取pcr产物5μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用dl 2000的dna mark作为片段大小的参照，于0.5
×
tbe缓冲液中，5v/cm电压下电泳30~40 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图3所示，泳道1～4采用的引物组为plp_vir1，标记片段大小为563 bp，其中泳道1和2是
‘
金秀’子实体样品，泳道3和4是
‘
秀57’子实体样品，表示携带有rna病毒；泳道5～8采用的引物组为plp_vir2，标记片段大小为521 bp，其中泳道5和6是
‘
金秀’子实体样品，泳道7和8是
‘
秀57’子实体样品，表示携带有rna病毒；m表示分量为dl 1000的dna mark，ck为空白对照。
24.实施例3：秀珍菇菌丝体rna病毒分子检测（1）秀珍菇菌丝培养和收集秀珍菇厂提供的
‘
金秀’和
‘
秀57’两个品种的菌种，将菌种转接至含pda培养基的直径90 mm的平皿中，25℃恒温培养至菌落长至平皿面积的3/4～4/5，收集菌丝，以1皿为1份，保存于液氮备用或直接用于提取rna。
25.（2）秀珍菇菌丝总rna提取应用omega的rna提取试剂盒（产品号：plant rna kit r6827）提取总rna，具体操作步骤依据产品说明书。提取的rna放-80℃保存备用或直接进行反转录，若放-80℃不超过7d。
26.（3）rna的反转录提取的rna应用反转录试剂盒（可用北京全氏金生物公司的反转录试剂盒，产品号：at311，或湖南艾科瑞生物工程有限公司的反转录试剂盒，产品号：ag11603）反转录成cdna，具体操作步骤依据产品说明书。转录好的cdna放-20℃保存备用或直接进行pcr检测。
27.（4）秀珍菇菌丝rna病毒特异性分子检测pcr扩增反应体系：cdna模板2μl，premix taq（含染料）12.5μl，10μmol/l正向引物1μl，10μmol/l反向引物1 μl，ddh2o 8.5μl；pcr扩增反应程序：94℃预变性5 min；98℃变性10sec，56℃退火30sec，72℃延伸50 sec, 35个循环;72℃延伸10 min。
28.（5）pcr产物的电泳检测取pcr产物5μl，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用dl 2000的dna mark作为片段大小的参照，于0.5
×
tbe缓冲液中，5v/cm电压下电泳30~40 min，电泳结束后，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图4所示，泳道9和11采用的引物组为plp_vir1，标记片段大小为563 bp；泳道10和12采用的引物组为plp_vir2，标记片段大小为521 bp；泳道9和10为
‘
金秀’的菌丝样品，结果显示携带有rna病毒，泳道11和12是
‘
秀57’的菌丝样品，结果显示携带有rna病毒，m表示分量为dl 2000的dna mark。
29.本发明所使用的主要培养基、试剂和仪器如下：pda固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 ml，ph自然，121℃灭菌30min。
30.rna提取试剂盒。
31.rna反转录试剂盒。
32.0.5
×
tbe：44.5 mmol/l tris, 50 mmol/l hbo3、1 mmol/l edta。
33.premix taq (ex taq version 2.0)带染料的和pcr扩增试剂，均购自大连宝生物公司。
34.本发明所使用的主要主要仪器如下：sw-cj-1fb型单人水平垂直两用净化工作台：苏州净化设备有限公司。
35.灭菌锅：上海三申。
36.spx-b-z系列恒温培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
37.冷冻离心机：sigma 3k30。pcr仪：eppendorf ag22331 hamburg。
38.掌型离心机：江苏海门市麒麟医用仪器厂lx-100手掌型离心机。
39.凝胶成像系统：tanon-2008。
40.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。