一种用于抑郁症诊断的tsrna生物标志物、试剂盒及其应用
技术领域：
：1.本发明涉及生物
技术领域：
：，具体而言，涉及一种用于抑郁症诊断的tsrna生物标志物、试剂盒及其应用。
背景技术：
：：2.抑郁症的核心症状是情绪低落、兴趣减退、精力缺失，在全球范围内有超过3.5亿人患有抑郁症。据估计至2030年，抑郁症所占伤残损失健康生命年将达到全球第一位。抑郁症具有高患病率、高复发率等特点，甚至会造成病人自杀、自残等严重后果。抑郁症给病人、家庭及社会带来巨大的经济压力和精神负担。目前抑郁症的诊断主要依赖病人的主观描述，临床医生对病人症状的主观评估和相关问卷进行诊断存在一定主观性，因缺乏客观有效的临床生物标志物，容易造成误诊漏诊，造成病程迁延，给病人造成不必要的经济和精神负担。因此，临床需要找到生物标志物来帮助临床医生对抑郁症做出早期诊断。3.非编码rna(non-codingrna,ncrna)即不编码蛋白质的rna，按照其长短分为长非编码rna(》200bp)和短非编码rna(《200bp)，广义上包括mrna、trna、rrna、小干扰rna、mirna以及功能尚未明确的长链非编码rna及环状rna。近年来，来源于trna衍生的小分子rna(trna-derivedsmallrnas,tsrnas)引起了广泛关注。其主要有2种类型，即trna源性应激诱导rna(trna-derivedstress-inducedrna,tirna)和trna源性片段(trna-derivedfragment,trf)。它们根据在前体或成熟trna转录物的切割位置不同而产生。这些trf&tirna分子的核苷酸组成、生物发生和功能上具有异质性。近年来研究发现tsrnas不仅仅是trna降解的碎片，而且在许多特定的生理和病理过程中起着调节作用。很多学者研究了mirna在抑郁症患者中的差异表达，提示mirna可能通过不同方式参与抑郁症的发生发展，例如神经可塑性、神经内分泌、心理社会因素、抗抑郁药等，而且认为mirna-26b、mirna-1972、mirna-4485、mirna-4498和mirna-4743等可以作为抑郁症的生物标志物。有研究通过lncrna芯片发现多种lncrna在抑郁症患者中异常表达，6种lncrnas在外周血中的表达可作为临床mdd诊断和治疗反应的潜在生物标志物。随后研究发现环状rnahsa_circrna_103636在抑郁症患者中下调，经过8周的抗抑郁治疗后表达上升提示hsa_circrna_103636可作为抑郁症的一个重要的诊断和治疗生物标志物。进一步在ⅱ型糖尿病合并抑郁的病人中发现hsa_circrna_003251，hsa_circrna_015115，hsa_circrna_100918，hsa_circrna_001520表达上调，这些circrna可能参与甲状腺激素，wnt,erbb和丝裂原活化蛋白激酶信号通路从而参与抑郁的发生、发展，研究阐明了ⅱ型糖尿病抑郁症的发病机制，并且可以作为临床诊断和治疗的新靶点。但是，上述抑郁症的生物标志物均存在稳定性不高的问题，也限制了其在临床上的应用。4.而tsrnas通过调控基因表达与基因沉默、调节细胞增殖与凋亡、调节翻译等方式在人类精神疾病中发挥重要作用。tsrnas组织特异性强、高度丰富且稳定、广泛存在的特征，使其有望成为具备高度敏感性、特异性和稳定性抑郁症诊断的生物标志物。技术实现要素：5.本发明所要解决的技术问题是针对当前用于抑郁症诊断生物标志物的稳定性不高的现状，提供一种具备高度稳定性、特异性和敏感性的tsrna作为诊断抑郁症的生物标志物。6.为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：一种用于抑郁症诊断的tsrna生物标志物，所述标志物包括编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna；所述tirna-gly-gcc-001为mintbase数据库中rna的编号，所述tirna-gly-gcc-001的核苷酸序列如序列表中sqeidno.1所示。7.与现有技术相比，本发明将编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna作为抑郁症诊断生物标记物和预测抗抑郁药物疗效的生物标记物，具有较高的稳定性，同时也具有较好特异性和敏感性，有较高的诊断参考价值。抑郁症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过tsrna表达水平这种客观指标检查进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程，且便于早期预测。通过检测编号为tirna-gly-gcc-001的特定tsrna表达水平对抗抑郁药物的疗效和抑郁症患者转归及预后情况进行预测。8.一种试剂盒，所述试剂盒中含有检测编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的引物和探针，所述tirna-gly-gcc-001的引物序列如sqeidno.2、sqeidno.3所示，所述试剂盒能够测定待测样品中编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的表达水平。通过试剂盒可对患者血液、血浆或血清中编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的表达量进行检测。9.进一步地，所述待测样品选自人体血液、血浆或血清中的至少一种。由于tsrna普遍存在于人体的血液、血浆和血清中，采用人体血液、血浆和血清作为待测样品，可有效检测其中的tirna-gly-gcc-001的表达量。10.进一步地，所述试剂盒含有检测试剂，所述检测试剂偶联有或带有可检测标记。通过在检测试剂中偶联或带有检测标记，便于通过检测标记的变化观察检测结果。11.进一步地，所述可检测标记选自生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶中的一种。采用生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶中的一种作为检测标记，可使检测结果更便于观察。12.进一步地，所述tsrna生物标志物在抑郁症诊断中的应用。将该tsrna生物标志物用于抑郁症诊断中，可提高诊断结果的稳定性。13.本发明还提供了所述试剂盒在抑郁症诊断或抗抑郁症药物疗效评估中的应用。将所述试剂盒应用到抑郁症诊断中，可并根据测得的编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的表达量判定患者是否患有抑郁症；将所述试剂盒应用到评估抗抑郁症药物疗效中，可根据测得的编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的表达量评估该抗抑郁症药物的疗效。14.进一步地，所述试剂盒在抗抑郁症药物疗效评估中的应用，具体包括以下步骤：15.s1、采用所述试剂盒测定正常人群受试者中血液、血浆或血清中的编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的浓度，记为对照参比值c0；16.s2、采用所述试剂盒测定检测对象的血液、血浆或血清中的编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的浓度，记为标志物表达量c1；17.s3、根据c1/c0的比值判断检测对象是否患有抑郁症，当所述标志物表达量c1与对照参比值c0接近，则表明通过抗抑郁药物有显著疗效。18.通过上述方法，可以评估抗抑郁症药物是否对患者有效，也评估患者的抑郁症是否被治愈。19.综上所述，本发明提供的tirna-gly-gcc-001作为抑郁症诊断的标准物及试剂盒和应用，将有利于临床上早期发现抑郁症，减少误诊漏诊，增加病人治疗依从性，减少病人和社会的经济负担和精神压力。附图说明20.图1为抑郁症病例组与健康对照组基因表达筛选的热图；21.图2为抑郁症病例组与健康对照组基因表达筛选的散点图；22.图3为抑郁症病例组与健康对照组基因表达筛选的火山图；23.图4为rt-pcr分析证实抑郁症病例组与健康对照组间tirna-gly-gcc-001差异性表达图；24.图5为不同严重程度抑郁症病例组tirna-gly-gcc-001的表达图；25.图6为抗抑郁治疗8周后tirna-gly-gcc-001的表达图；26.图7为样本经4h,8h,24h室温放置后,tirna-gly-gcc-001的表达变化图；27.图8为样本经2，4，6次反复冻融后，tirna-gly-gcc-001的表达变化图；28.图9为tirna-gly-gcc-001的抑郁症诊断roc曲线。具体实施方式29.下面将结合实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如mulliskb等人，聚合酶链式反应(nature.1986nov13-19；324(6093):163-6.)中的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。30.实施例131.本实施例提供了一种用于抑郁症诊断的tsrna生物标准物，生物标志物包括编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna；编号为mintbase数据库中rna的编号，tirna-gly-gcc-001的核苷酸序列如序列表中sqeidno.1所示。32.与现有技术相比，本发明通过将编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna作为抑郁症诊断生物标记物和预测抗抑郁药物疗效的生物标记物，具有较高的稳定性、特异性和敏感性，有较高的诊断参考价值。抑郁症的诊断将不依靠主观经验判断，而是可以通过tsrna表达水平这种客观指标检查进行确诊，提高诊断准确率，简化诊断过程，且便于早期预测。通过检测编号为tirna-gly-gcc-001的特定tsrna表达水平对抗抑郁药物的疗效和抑郁症患者转归及预后情况进行预测。进一步可通过tsrna模拟物和拮抗物(修饰寡核苷酸)改变特定tsrna表达水平能够使异常的基因调控网络和信号通路正常化，进而对抑郁症某种特定症状进行针对性治疗从而治疗抑郁症。33.实施例234.本实施例提供了一种抑郁症诊断试剂盒，试剂盒能够测定血液、血浆或血清中编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna，血液、血浆或血清中的任意一种为待测样品，编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna为风险标准物，编号为mintbase数据库中rna的编号，血液、血浆或血清来源于人，诊断试剂盒内的诊断试剂偶联有或带有可检测标记，可检测标记选自生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶中的一种；诊断试剂盒中含有检测编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的引物和探针，tirna-gly-gcc-001的引物序列如sqeidno.2、sqeidno.3所示；诊断试剂盒中还包括pcr扩增检测常规组件，pcr扩增检测常规组件包括taq酶、逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、depc水、标准品和对照品；诊断试剂盒中还包括pcr扩增检测辅助组件，pcr扩增检测辅助组件包括阴性对照品、阳性对照品、荧光定量pcr反应板和pcr反应板封口膜。35.实施例336.本实施例提供一种评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒，试剂盒能够测定血液、血浆或血清中编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna；编号为mintbase数据库中rna的编号；评估包括早期诊断、辅助性诊断及其结合；评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒中含有检测编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的引物和探针，tirna-gly-gcc-001的正向引物如sqeidno.2所示，tirna-gly-gcc-001的反向引物如sqeidno.3所示；评估试剂盒中还包括pcr扩增检测常规组件，pcr扩增检测常规组件包括taq酶、逆转录酶、缓冲液、dntps、mgcl2、depc水、标准品和对照品；评估试剂盒中还包括pcr扩增检测辅助组件，pcr扩增检测辅助组件包括阴性对照品、阳性对照品、荧光定量pcr反应板和pcr反应板封口膜。37.本实施例还提供了采用本实施例提供的评估抗抑郁症药物疗效的试剂盒评估抗抑郁症药物疗效的方法，包括以下步骤：38.s1、采用试剂盒测定正常人群受试者中血液、血浆或血清中的编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的浓度，记为对照参比值c0；39.s2、采用试剂盒测定检测对象的血液、血浆或血清中的编号为tirna-gly-gcc-001的tsrna的浓度，记为标志物表达量c1；40.s3、根据c1/c0的比值判断检测对象是否患有抑郁症，当标志物表达量c1与对照参比值c0接近，则表明通过抗抑郁药物有显著疗效。41.应用例42.一、研究对象43.本研究获得宁波市康宁医院医学伦理委员会批准，所有受试者或受试家属(监护人)均签署知情同意书。44.病例组：病例组研究对象为2019年1月至2021年12月，在宁波市康宁医院精神科门诊和住院的符合抑郁症诊断标准的患者共90例，所有患者符合下列入组标准：1.满足美国精神疾病诊断与统计手册第5版(dsm‑ⅴ)中抑郁症发作的诊断标准；2.两名主治医师对其进行汉密尔顿量表(24项版)评分≧7分；3.年龄18岁-60岁；4.右利手；5.近3个月未用过任何抗抑郁药物、抗精神病药物。排除标准为：1.既往有严重器质性疾病或药物继发的情感障碍、精神障碍或人格障碍；曾有酒精或其它物质滥用史；2.妊娠或哺乳期女性；3.近6个月内进行过无抽搐电休克治疗(mect)，或长期使用过抗精神病药物；需长期合并使用可能影响情绪的药物者；近期需长期使用中枢神经系统作用的药物；对所用研究药物(米氮平、舍曲林、艾司斯西酞普兰)过敏。45.对照组：健康对照组为同期体检的60例健康志愿者，要求年龄在20岁-60岁之间，与病例组年龄和性别相匹配。经过structuredclinicalinterviewfordsm‑ⅴ,nonpatientedition(scid-i/np)检查以确认他们没有患抑郁症和其它精神疾病，而且本人及两系亲属中无精神疾病史，本人无严重神经系统疾病或其它严重躯体疾病、严重脑外伤史，近3个月内无严重应激事件，右利手，采血前1个月内未患疾病或服用任何药物。46.在开展研究前，首先对参加本课题的精神专科医师和研究生进行培训。采用汉密尔顿抑郁量表(hamd)、大体评定量表(gas)、临床疗效总评量表(cgi)在病例入组前、药物治疗4周后、药物治疗8周后分别进行评估。由两位精神科主治医师根据dsm-iv-tr对患者进行诊断，如果出现不一致情况，则请一位精神科主任医师共同讨论后确定诊断。47.入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。同样，记录正常对照组一般情况。48.二、研究方法49.①使用量表50.汉密尔顿抑郁量表(hamd)：由心理学家hamilton于1960年编制，是目前临床评定抑郁状态时应用最为普遍的量表。本研究采用24项中国版本，分为7个因子，分别是焦虑/躯体化，体重，认知症状，日夜变化，阻滞，睡眠障碍和无助，其信度和效度已经得到验证。51.大体评定量表(gas)：大体评定量表是评价各类精神疾病症状的量表，在同类量表中是应用最广泛的一种。本研究使用的是美国心理卫生研究所(nimh)1976年的spitzer版本，共有10级评定分(1～10分)，根据患者临床症状进行评定。总分越高，说明病情越轻。本研究中使用gas量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。52.临床疗效总评量表(cgi)：临床疗效总评量表由who设计，用于国际精神疾病试点调查(ipss)的研究，现用以评定临床疗效，适用于任何精神科治疗和研究对象。量表分为病情严重程度(severityofillness，si)，疗效总评(globalimprovement，gi)和疗效指数(efficacyindex，ei)三个分量表。本研究中使用cgi量表的中文版本进行评估，该版本经信效度检验分析，达到心理测量学标准。本研究中使用疾病严重程度分(severityofillness，si)和疗效总评分(globalimprovement，gi)进行统计分析。53.②资料收集54.入组时记录一般情况(姓名、性别、年龄、文化程度、职业、收入水平、婚姻状况、药物成瘾史及精神疾病家族史等)。由23名精神科主治医师或医师使用汉密尔顿抑郁量表(hamd)和临床疗效总评量表(cgi)于用药前及用药6周以上对病例组被试进行评定。评定前，所有参与研究人员进行统一培训，统一方法学等，保证施测过程标准化。其中hamd使用总分和因子分统计，cgi使用疗效总评分(globalimprovement,gi)统计。55.③药物干预56.90例进行临床药物干预随访观察。对其中25例服用米氮平(剂量范围7.5-45mg，起始剂量7.5mg，平均剂量30mg)联合艾司西酞普兰(剂量范围20-40mg，起始剂量20mg，平均剂量30mg)，20例采用每日服舍曲林(剂量范围50-150mg，起始剂量50mg，平均剂量100mg)联合米氮平，22例服用氟伏沙明(剂量范围50-150mg，起始剂量50mg，平均剂量100mg)联合米氮平，12例服用文拉法辛(剂量范围75-150mg,起始剂量75mg,平均剂量125mg)，11例服用氟西汀(剂量范围20-40mg,起始剂量20mg,平均剂量30mg)，见表2。57.表290例患者抗抑郁药种类及剂量(mg)[0058][0059][0060]④主要试剂和耗材[0061]lowinputquick-amplabelingkit，one-color(24*)(agilent，货号：5190-2305)；geneexpressionwashpack(agilent，5188-5327)；geneexpressionhybridizationkit(5188-4242)；rnaspikeinkit，one-color(5188-5327)；荧光定量pcr引物：customplustqmnrnaassays(美国abi公司)；荧光定量pcr试剂：taqman通用混合试剂盒ⅱ(美国abi公司，货号：4440047)；反转录试剂盒：quantitectrev.transcriptionkit(qiagen，货号：205311)。[0062]⑤主要仪器[0063]扫描仪(affymetrix，scanner3000)；杂交炉(affymetrix，hybridizationoven640)；洗涤工作站(affymetrix，fluidicsstation450)；2100(agilent，g2939a)；2100振荡器(agilent，9600)；nanodrop(thermo，2000)；pcr仪(abi，9700)；离心机(eppendorf，5418)；浓缩仪(eppendorf，5301)；离心机(其林贝尔，lx-200)；离心机-1(其林贝尔，lx-300)；振荡器ꢀ‑1(其林贝尔，gl-88b)；磁力搅拌器(其林贝尔，gl-3250b)；金属浴-2(博日，hb-100)；金属浴-3(博日，chb-100)；电热恒温培养箱(精宏实验设备，xmtd-8222)；冰箱(荣事达，bcd-265f)；abi9700型pcr仪(美国abi公司)；天美ct14rd型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；nanodrop1000超微量紫外分光光度计(附电脑1套，美国thermo公司)；abi7900htfastread-timepcrsystem(美国abi公司)；wh-2微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；js-400a恒温金属浴(上海培清科技有限公司)；dk-8d数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；sw-cj-ifd型单人单面净化工作台(苏净净化设备有限公司)；-80℃超低温冰箱(海尔公司)。[0064]⑥tsrna测序筛查[0065]使用康成生物trf&tirnaseq平台，完成对重度抑郁患者5人，正常对照5人共10个样本检测和分析。样品总rna利用nanodropnd-2000(thermoscientific)定量并经agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies)检测rna完整性。rna质检合格后进行测序分析[0066]⑦总rna抽提与荧光定量pcr[0067]对测序筛查结果中的10种差异表达的tsrnas进行后续的qrt-pcr验证。所有被试使用edta抗凝管采肘静脉血5ml，采血后轻轻摇动抗凝管使抗凝剂与血液混匀，所有血样在采血后2小时内进行rna提取。trizol(usa)法提取出血清中总rna(包括tsrna)，具体操作按照试剂盒说明书进行。按照rna逆转录试剂盒(taqmanrna反转录试剂盒，美国abi公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为15μl(总rna5μl，taqmanmicrornaassay3μl，核酸酶free水4.16ul，rnase抑制剂0.19μl，缓冲液1.5μl，multiscribe逆转录酶1μl和dntp0.15μl)，在不同温度下(16℃，42℃，85℃，4℃)进行不同时长(30mins，30mins，5mins，10mins)反应。实时荧光定量pcr按照taqman试剂盒(taqman通用混合试剂盒ii，美国abi公司)说明书进行。pcr扩增体系总体积为10μl，反应共40个循环。pcr反应ct值通过7900实时荧光定量pcr仪(美国abi公司)测定，每个反应重复三次。使用sds2.4和dataassistv3.0软件进行数据读取和分析，选择β-actin为内参进行数据标准化。[0068]⑧统计学处理[0069]全部数据使用spssv19.0统计软件进行统计分析。用独立样本t检验和四格表资料的fisher确切概率法(fisherexactprobabilitiesin2×2table)检测两组在年龄和性别有无显著性差异。采用随机方差模型(randomvariancemodel,rvm)校正后进行两分类差异基因筛选(twoclassificationdifferencegeneticscreening,twoclassdif)，得到显著差异表达的tsrna。以tsrna与内参β-actin之间阈值环(thresholdcycle,ct)之差计算δct值。使用wilcoxonranksumtest分别对比分析抑郁症组与对照组间tsrna的表达差异，用非参数检验分析对筛选到的tirna-gly-gcc-001在治疗前、治疗4周和治疗8周的前后表达变化，以及抑郁症组与对照组不同性别、不同年龄段间的差异。[0070]三、研究结果[0071]1、测序结果分析发现，抑郁症组5例患者与对照组5名正常人其tsrna经测序分析后发现均可呈现高低表达2大趋势，说明抑郁症组和对照组间tsrnas可能存在差异性表达。以p《0.05为差异有统计学意义，误判率(fdr)为校正后p值，经rvmt-test分析共筛选出37条差异表达的tsrnas，其中34条表达上调，3条表达下调，如图1所示，以log2(foldchange)为横坐标，表示2倍的基因上调或下调；以t检验显著性检验p值的负对数-log10(p-value)为纵坐标，因此黑色区域代表统计学上有显著性差异的基因表达，结果见图1、图2和图3。[0072]2、采用rt-qpcr验证测序分析结果，就测序筛查到的37个tsrnas，经过充分研究，我们验证出抑郁症中异常表达的tirna-gly-gcc-001。结果见图4。[0073]3、共送检抑郁症组90例和健康对照组60例，根据hamd-17量表得分将抑郁症患者分为轻度抑郁症，中度抑郁症，重度抑郁症，结果如图5所示，随着抑郁程度的加重，tirna-gly-gcc-001的表达量也随之升高。[0074]4、入组的抑郁症患者经过8周的抗抑郁治疗后，随着hamd得分率的下降，抑郁症状的缓解，tirna-gly-gcc-001的表达也随之下降，结果见如图6。[0075]5、tirna-gly-gcc-001在经过4h、8h、24h室温放置后，表达未见明显变化，结果见图7。[0076]6、tirna-gly-gcc-001在经过2、4、6个循环反复冻融后稳定性未见明显变化，结果见图8。[0077]7、roc曲线分析提示rt-pcr验证的差异性表达的tirna-gly-gcc‑ꢀ001在抑郁症的诊断价值。tirna-gly-gcc-001的auc为0.84(95％ci：0.65-0.96)，敏感值为0.80，特异值为0.93，见图9。[0078]虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12