一株能够改变模拟胃肠道环境中胆汁酸含量且具有缓解便秘作用的长双歧杆菌及其应用

1.本发明涉及一株能够改变模拟胃肠道环境中胆汁酸含量且具有缓解便秘作用的长双歧杆 菌及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.胆汁酸是人体胆汁的重要成分，在人体内发挥着消化脂肪、吸收的功能。现在越来越多 的报道显示，胆汁酸是人体重要的信号分子，在各个器官发生着重要的作用。正常人的胆汁 酸池大约是3～5克，每天进行着8～12次的肝肠循环，其中有95％的胆汁酸参与循环代谢， 剩余5％会通过粪便和尿液排出体外。所以肝脏每天就负责合成这5％的胆酸，来维持胆汁 酸池的稳定性。在肝脏里是以胆固醇为原料，经过肝酶的步步代谢，最终合成了结合型的初 级胆汁酸排入肠道。肠道中的胆汁酸经过肠道菌群的多步代谢，构成了胆汁酸谱的丰富多样 性。结合型的胆汁酸进入肠道以后，首先由富含胆盐水解酶的肠道菌，将结合型的胆汁酸代 谢成非结合型的胆汁酸，这些富含胆盐水解酶的菌群包括了有拟杆菌、梭菌、乳酸杆菌、双 歧杆菌、李斯特菌等等。进一步，肠道菌群对胆汁酸骨架结构上的，主要是7位，也有3位、 6位、12位上的羟基进行修饰，进行脱羟基、脱氢、异构化等功能，最终形成了次级胆汁酸。 参与这些代谢的菌群包括了拟杆菌、梭菌、埃希氏菌、瘤胃球菌等等。甘氨胆汁酸作为一种 重要的胆汁酸，在代谢异常的情况下会导致肝脏疾病、代谢疾病等多种疾病。一般情况下， 只有当肝细胞严重受损，或者是胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍时才会造成甘胆酸偏高。 但是造成肝细胞受损的原因有很多，其中各种病毒性肝炎疾病是引起肝功能指标甘胆酸偏高 的主要原因，所以患者警惕病毒性肝炎很关键。另外，据相关数据统计，急性肝炎、慢性活 动性肝炎、原发性肝癌、肝硬化患者肝功能检查指标甘胆酸均明显高于正常人，且呈递性增 高。而且经验证，造成这些患者甘胆酸的含量增高的原因是肝脏发生病变，肝功能受损，肝 细胞摄取甘胆酸的能力下降，才导致血清中甘胆酸的含量增高的。除此之外，如果胆汁淤积 时，肝脏排泄甘胆酸也会发生障碍，而回流于血液促使甘胆酸的含量增高。因此，调节胆汁 酸代谢，尤其是甘氨胆汁酸的代谢，对于调节其与机体健康和疾病方面的作用可以起到一定 的推动作用。
3.近年来，随着研究方法的不断深入，大量的研究发现胆汁酸的调节与脂质代谢疾病或肝 脏疾病相关。例如，c.degirolamo等学者在2014年发表在cell reports的一篇文献证明补充 益生菌产品vsl#3可以显著改变胆汁酸的肝肠循环，主要是改变tca/tβmca及总胆汁酸的 含量。susan a.joyce等学者在2014年发表在pnas的一篇文献证明通过益生菌产的胆盐水 解酶能够显著改变胆汁酸的组成，主要是改变牛磺胆汁酸的含量而实现的。
4.便秘作为一种严重影响生活质量的疾病，受到越来越多的关注。有流行病学的调查显示， 便秘在全球范围的发病率为0.7％-79％(平均达16％)；仅在我国就有3％-17％的发病率。引 发便秘的原因有很多，例如饮食的不均衡、微生物紊乱、药物的副作用、糖尿病等代谢性疾 病所导致的并发症、遗传疾病、机械性肠梗阻、神经疾病等。针对不同的发病原
因，治疗手 段也不尽相同。对于病情较轻者，常鼓励他们多食用新鲜蔬菜、水果、豆类等膳食纤维含量 丰富的食物，但是部分病情较为严重的患者，可以使用渗透性或刺激性泻药，如聚乙二醇、 乳果糖或蒽醌衍生物等，但是这类泻药常会引起依赖性，甚至恶心、腹痛、腹泻等副作用， 若患者已严重至肠道组织发生了明显的病变，则需要进行手术来进行治疗。因此，益生菌作 为一种副作用较小、缓解效果较为明显，且依赖性较弱的治疗手段，目前已逐渐得到大家的 广泛认可。
5.目前，针对双歧杆菌相关的生理功能已有国内外的学者进行研究，而其对便秘缓解作用 的应用还应该得到更深刻的探究。无论是将其制成菌剂还是加入到食品中制成功能性食品， 都有非常大的应用前景，能够预防便秘的发生甚至治疗便秘。通过对双歧杆菌缓解便秘进行 研究，将会对食品科学、微生物学以及预防医学等各方面产生巨大的影响，因此，双歧杆菌 缓解便秘的研究是十分必要的。
6.相关专利：马克
·g·
科里等人的专利(cn111050755a)报道，考来维仑或盐酸考来维仑胆汁 酸螯合剂能够通过降低消化道中胆汁酸水平，进而缓解胃食管反流疾病病人的症状。这些数 据表明了一些药物的摄入对于调节胆汁酸代谢有显著的作用。然而，对于益生菌调节甘氨胆 汁酸的代谢仍处于空白状态。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，本发明提供了一种长双歧杆菌(bifidobacterium longum subsp. longum)ccfm1077，已于2019年9月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为 gdmcc no：60769，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
8.本发明还提供了含有所述长双歧杆菌ccfm1077的微生物制剂。
9.在一种实施方式中，所述微生物制剂中长双歧杆菌ccfm1077的活菌数不低于1
×
10
6 cfu/ml或1
×
106cfu/g。
10.本发明还提供了一种调节胆汁酸代谢的产品，所述产品中含有所述长双歧杆菌 ccfm1077。
11.在一种实施方式中，所述产品中长双歧杆菌ccfm1077的活菌数不低于1
×
106cfu/ml 或1
×
106cfu/g。
12.在一种实施方式中，所述产品为可摄入胃肠道的食品、药物或保健品。
13.在一种实施方式中，所述食品包括发酵果蔬、发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或其他含 有上述长双歧杆菌的食品。
14.本发明还提供了上述长双歧杆菌ccfm1077或上述微生物制剂在制备降低甘氨胆汁酸含 量、提高脱氢胆汁酸含量和/或缓解便秘的产品中的应用。
15.在一种实施方式中，所述甘氨胆汁酸包括但不限于甘氨猪胆汁酸、甘氨猪脱氧胆酸、甘 氨熊脱氧胆汁酸中的至少一种。
16.在一种实施方式中，所述脱氢胆汁酸包括但不限于3-脱氢胆酸、7-脱氢胆酸、12-脱氢胆 酸中的至少一种。
17.在一种实施方式中，所述缓解便秘包括但不限于提高粪便含水量、降低肠道转运时间。
18.有益效果：
种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活 化液按2％(v/v)的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃条件下培养18h，得到菌液；将菌 液经8000g离心10min，得到长双歧杆菌菌体；将长双歧杆菌菌体经生理盐水洗涤后重悬于 浓度为200g/l的甘油溶液(含1g/l半胱氨酸盐酸盐)中至菌浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到菌悬 液，将菌悬液于-80℃下保存待用。
38.实施例1：长双歧杆菌ccfm111077的分离筛选
39.(l)取1g健康人的新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mmrs固体培养基，置于厌氧环境下 37℃培养72小时；
40.(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化；
41.(3)在mrs液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形 态。
42.(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
43.(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
44.(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
45.(1)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体mmrs培养液中培养24h，然后取lml 培养物8000rpm离心2min；
46.(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸盐酸盐的ph6.5的0.05m kh2po4溶液洗涤两 次；
47.(3)重悬于200μl添加了0.25％(质量百分数)triton x-100的上述磷酸盐缓冲液；
48.(4)添加50μl浓度为6mg/ml氟化钠和10mg/ml碘乙酸钠的混合液以及50μl浓度为 80mg/ml的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
49.(5)添加300μl浓度为0.139g/ml、ph 6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；
50.(6)分别添加200μl15％(质量百分数)的三氯乙酸和4m hci；
51.(7)添加200μl含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1m hci，体系迅速变为红色，即 为f6ppk阳性，初步断定其为双歧杆菌。
52.(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定：
53.(l)单菌基因组抽提：将步骤(二)所筛选得到的双歧杆菌培养过夜，取培养过夜的菌 悬液lml于1.5ml离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；用lml无菌水吹洗菌体后， 10000rpm离心2min，弃上清得菌体；加入200μl sds裂解液，80℃水浴30min；加入酚-氯 仿溶液200μl于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为tris饱和酚:氯仿:异 戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μl；加入400μl冰乙醇或 冰异丙醇于200ul上清中，-20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；加入500μl70％ (体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；60℃烘箱烘干，或者自然 晾干；50μl ddh2o重溶沉淀以备pcr；
54.(2)16s rdna pcr：
55.a.细菌16s rdna 50μlpcr反应体系：
56.10
×
taq buffer，5μl；dntp，5μl；27f，0.5μl；1492r，0.5μl；taq酶，0.5μl；模板， 0.5μl；ddh2o，38μl。
57.b.pcr条件：
58.95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-4 30
×
；72℃5min；12℃2min；
59.c.制备1％琼脂糖凝胶，之后将pcr产物与10000
×
loading buffer混合，上样量2μl，120v 跑30min，然后进行凝胶成像；
60.d.将得到pcr产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用blast在genebank中 进行搜索和相似性比对，鉴定为长双歧杆菌。
61.(3)全基因组测序
62.将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到 的序列结果使用blast在genebank中进行搜索和相似性比对，鉴定结果表明b.longumccfm 1077与标准菌株bifidobacterium longum ncc2705基因组平均核苷酸一致性(ani)为 98.3％，高于菌种鉴定种水平阈值(≥95％)，上述结果表明该菌株为一株新的长双歧杆菌菌 株。菌株i3、b3、j3、s7筛选自健康成年人粪便样本，经鉴定为长双歧杆菌，后续实验作为 对照菌株使用(菌株i3、b3、j3已公开于论文《strain-specific effects of bifidobacterium longumon hypercholesterolemic rats and potential mechanisms》中)。菌株-80℃保藏备用。
63.实施例2：长双歧杆菌长亚种ccfm1077对模拟胃肠液具有良好的耐受性
64.将冷冻保存的长双歧杆菌长亚种ccfm1077接种于mmrs培养基(mrs培养基+0.05％ 半胱氨酸盐酸盐)中，在温度37℃厌氧培养48h，再经mmrs培养液传代培养2～3次后， 取1ml长双歧杆菌长亚种ccfm1077的培养液，与9.0ml ph 2.5人工模拟胃液(含1％胃 蛋白酶、ph＝2.5的mmrs培养基)混合，并在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1h和2h 时取样，用mmrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率。
65.存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表 示。取1ml长双歧杆菌长亚种ccfm1077的培养液加入9ml人工模拟肠液(含0.3％牛胆 盐、1％胰蛋白酶、ph＝8.0的mmrs培养基)中，在37℃下厌氧培养，分别在0h、0.5h、1 h和2h时取样，用mmrs琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活 率。存活率是在该培养液中在取样时的活菌数对数值与在第0h时活菌数对数值之比，以％表 示。实验结果如表1和表2所示。结果表明，长双歧杆菌长亚种ccfm1077对人工胃肠液具 有较好的耐受性。
66.表1长双歧杆菌长亚种ccfm1077在人工模拟胃液中的耐受性
[0067][0068]
表2长双歧杆菌长亚种ccfm1077在人工模拟肠液中的耐受性
[0069][0070]
实施例3：长双歧杆菌ccfm1077降低模拟胃肠液环境下甘氨胆汁酸含量的作用
[0071]
取来源于新划线和生长的固体培养基中的单个菌体接种至10ml mrs液体培养基，并置 于37℃的厌氧培养箱，培养18小时。每个培养液归一化至od
600
值为1，然后制备菌体，用 pbs冲洗两次。将冲洗后的菌体重悬，取1ml菌体加入含0.5％猪胆囊源性胆汁的lb肉汤培 养基中。在已经添加猪胆汁酸的lb培养基中中加入缺失的人体内的胆汁酸，包括：胆酸 (cholic acid)、α-muricholic胆酸、β-muricholic胆酸、ω-muricholic胆酸)。1ml菌浓 为1
×
107cfu/ml的菌悬液与胆汁共孵育1.5小时。同时加入了胆酸和鹅去氧胆酸的氘化内 标。接着在离心机中离心，离心条件：10000g，10min。取上清液，用1体积甲醇(分为2 管)最终浓度为50％的甲醇萃取。将混合物在-20℃下静置30分钟并进行涡流处理。然后在氮 气下真空干燥，再用乙腈和甲酸(1ml)重新提取。在此步骤中，样品被汇集在一起。提取液离 心并干燥，在ms检测当天再用150μl 50％甲醇重悬，或在-20℃保存干燥直到uplc-ms检 测当天。结果显示，ccfm1077能显著下调甘氨胆汁酸含量(1858.4ng/ml)，与空白对照 组(15156.4ng/ml)相比，降低了87.7％(图2)，甘氨猪胆汁酸含量由440317.95ng/ml降至 20112.2ng/ml，降低了95.4％(图3)，甘氨猪脱氧胆酸含量由348530.8ng/ml降至3350.6 ng/ml，降低了99.1％(图4)，甘氨熊脱氧胆汁酸含量由5061.4ng/ml降至928.0ng/ml，降 低了81.7％(图5)。
[0072]
实施例4：长双歧杆菌ccfm1077提高模拟胃肠液环境下脱氢胆汁酸含量的作用
[0073]
取来源于新划线和生长的固体培养基中的单个菌体接种至10ml mrs液体培养基，并置 于37℃的厌氧培养箱，培养18小时。每个培养液归一化至od
600
值为1，然后制备菌体，用 pbs冲洗两次。最后的具体重悬于含0.5％猪胆囊源性胆汁的lb肉汤培养基中。在主混合胆 汁酸lb中加入相应缺失的胆汁酸-胆汁酸、胆酸(α，β，ω)及其共轭形式。菌体与胆汁共孵育 1.5小时。同时加入了胆酸和鹅去氧胆酸的氘化内标。接着在离心机中离心，离心条件：10000g， 10min。取上清液，用1体积甲醇(分为2管)最终浓度为50％的甲醇萃取。将混合物在-20℃ 下静置30分钟并进行涡流处理。然后在氮气下真空干燥，再用乙腈和甲酸(1ml)重新提取。 在此步骤中，样品被汇集在一起。提取液离心并干燥，在ms检测当天再用150μl 50％甲醇重 悬，或在-20℃保存干燥直到uplc-ms检测当天。结果显示，与空白对照组相比，长双歧杆 菌ccfm1077能使3-脱氢胆酸的含量从8.8ng/ml升高至1331.5ng/ml，升高了150倍(图 6)，使7-脱氢胆酸的含量从16.6ng/ml升高至180.7ng/ml，升高了9.9倍(图7)，使12-脱 氢胆酸的含量从120.0ng/ml升高至408.1ng/ml，升高了2.4倍(图8)。
[0074]
实施例5：长双歧杆菌ccfm1077用于制备发酵牛乳
[0075]
长双歧杆菌ccfm1077可用于制备发酵牛乳，牛乳的具体制备过程如下：
[0076]
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌ccfm1077的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量 接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用ph 7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到悬浮液；将悬浮 液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵剂；
[0077]
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、 0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其ph为6.8，得到培养基；
[0078]
保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、 10g/l l-谷氨酸钠；
[0079]
(2)将脱脂奶在95℃热杀菌20min后冷却至4℃，得到原料；在原料中添加步骤(1) 制得的发酵剂至浓度为不低于1
×
106cfu/ml，得到牛乳(牛乳需在4℃下冷藏保存)。
[0080]
实施例6：长双歧杆菌ccfm1077用于制备发酵豆乳
[0081]
长双歧杆菌ccfm1077可用于制备豆奶，豆奶的具体制备过程如下：
[0082]
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌ccfm1077的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量 接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用ph 7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到悬浮液；将悬浮 液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵剂；
[0083]
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％脱脂乳、0.5％葡 萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其ph为6.8，得到培养基；
[0084]
保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、 10g/l l-谷氨酸钠；
[0085]
(2)将大豆在温度80℃下浸泡2h后去除大豆皮，得到去皮大豆；将去皮大豆沥去浸泡 水后加沸水磨浆，得到豆浆；将豆浆在高于80℃的温度条件下保温12min，得到熟豆浆；将 熟豆浆用150目筛网过滤后离心分离，得到粗豆奶；将粗豆奶加热到温度140～150℃后迅速 导入真空冷却室进行抽真空，使得粗豆奶中的异味物质随着水蒸汽迅速排出，得到熟豆奶； 将熟豆奶降温至约37℃后在熟豆奶中添加步骤(1)制得的发酵剂至浓度为不低于 1
×
106cfu/ml，得到豆奶(豆奶需在4℃下冷藏保存)。
[0086]
实施例7：长双歧杆菌ccfm1077用于制备果蔬饮品
[0087]
长双歧杆菌ccfm1077可用于制备蔬菜饮料，蔬菜饮料的具体制备过程如下：
[0088]
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌ccfm1077的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量 接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用ph7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到悬浮液；将悬浮 液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到发酵剂；
[0089]
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、 0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其ph为6.8，得到培养基；
[0090]
保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、 10g/l l-谷氨酸钠；
[0091]
(2)将新鲜蔬菜洗净后榨汁，得到蔬菜汁；将蔬菜汁在温度140℃下高温热杀菌2秒， 得到杀菌后的蔬菜汁；将杀菌后的蔬菜汁降温至约37℃后在杀菌后的蔬菜汁中添加步骤(1) 制得的发酵剂至浓度为不低于1
×
106cfu/ml，得到蔬菜饮料(蔬菜饮料需在4℃下冷藏保存)。
[0092]
实施例8：长双歧杆菌ccfm1077用于制备胶囊制品
[0093]
长双歧杆菌ccfm1077可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
[0094]
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌ccfm1077的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量 接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用ph7.2的磷酸盐缓冲液清洗2次后用脱脂乳重悬至浓度为2
×
10
10
cfu/ml，得到悬浮液；
[0095]
(2)将步骤(1)制得的悬浮液添加至浓度为3％的海藻酸钠溶液中至浓度为2
×
109cfu/ml 后，充分搅拌，使得长双歧杆菌ccfm1077的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合 液；将混合液挤压到浓度为2％的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后， 过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；将粉剂装入到药用胶囊中， 得到胶囊制品。
[0096]
实施例9：长双歧杆菌ccfm1077用于制备发酵乳制品
[0097]
长双歧杆菌ccfm1077可用于制备发酵乳，发酵乳的具体制备过程如下：
[0098]
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌ccfm1077的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量 接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用ph7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到悬浮液；将悬浮 液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到冻干粉，菌粉中菌体浓度为1
×
109cfu/g；
[0099]
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、 0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其ph为6.8，得到培养基；
[0100]
保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、 10g/l l-谷氨酸钠；
[0101]
(2)将冻干粉与商业干粉发酵剂保加利亚乳杆菌(菌体浓度为1
×
109cfu/g)和商业干 粉发酵剂嗜热链球菌(菌体浓度为1
×
109cfu/g)按照质量比1:1:1的比例混合，得到发酵剂， 发酵剂中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的菌浓为2％；
[0102]
(3)将糖添加至鲜奶中至浓度为5％，得到混合液；将混合液在65℃、20mpa的条件下 进行均质后在95℃下保温杀菌5min，得到发酵原料；将发酵原料降温至35℃后以0.03％(v/v) 的接种量将步骤(2)制得的发酵剂接种至发酵原料中，于35℃下保温发酵16h，得到发酵乳； 将发酵乳于42℃的条件下凝乳后，在4℃下冷藏24h进行后熟，得到发酵乳成品。
[0103]
实施例10：长双歧杆菌ccfm1077的应用
[0104]
长双歧杆菌ccfm1077可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
[0105]
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌ccfm1077的二级纯化培养液以3％(v/v)的接种量 接种到培养基中，在温度37℃下培养18h，得到菌液；将菌液离心，得到菌泥；将菌泥用ph7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用保护剂重悬至浓度为1
×
10
10
cfu/ml，得到悬浮液；将悬浮 液在温度37℃下预培养60min后冻干，得到菌粉；
[0106]
其中，培养基的制备方法为：使用以培养基总重量计87.7％的水将10％酶水解脱脂乳、 0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白胨与0.3％酵母浸膏溶解，然后调整其ph为6.8，得到培养基；
[0107]
保护剂的成分包含：100g/l脱脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麦芽糊精、150g/l海藻糖、 10g/l l-谷氨酸钠；
[0108]
(2)称取步骤(1)制得的菌粉25.7重量份、淀粉55.0重量份、纤维素衍生物4.5重量 份、羧甲基淀粉钠12.0重量份、滑石粉0.8重量份、蔗糖1.0重量份与水1.0重量份，得到原 材料；将原材料混合，得到湿颗粒；将湿颗粒用中南制药机械厂的压片机进行压片后使用青 州市益康中药机械有限公司的小型药物干燥机进行干燥，得到片剂。
[0109]
将实施例5～10制备的产品加入至模拟胃肠液环境，结果显示，含有长双歧杆菌 ccfm1077的产品均具有调节甘氨胆汁酸含量和/或脱氢胆汁酸含量的作用。
[0110]
实施例11：长双歧杆菌ccfm1077对洛哌丁胺诱导产生便秘相关症状的缓解
[0111]
将50只8周龄的雄性balb/c小鼠适应1周后，按照每组10只小鼠随机分成5组，包 括空白对照(灌胃生理盐水)、便秘模型组(灌胃洛哌丁胺和生理盐水)、阳性药物(酚酞) 对照组(灌胃洛哌丁胺和7mg/ml酚酞溶液)、长双歧杆菌s7组和长双歧杆菌ccfm1077 组(灌胃洛哌丁胺和菌浓为1
×
109cfu/ml的长双歧杆菌的菌悬液)，灌胃14天。小鼠饲养 在恒温恒湿(温度：25
±
2℃；湿度：55％
±
5％)动物房内ivc笼盒中，维持12h黑暗和12 h光照循环，实验期间给予小鼠标准商业鼠粮和自由饮水。动物实验方案经江南大学伦理委 员会批准(jn.no20180615b0800804[159])，实验操作按照欧盟制定的实验动物指南(directive2010/63/eu)执行。
[0112]
实验结束前收集小鼠粪便，实验结束后，小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液麻醉，收集血 液、结肠内容物，测量墨汁推进长度，样本冻存在-80℃冰箱中，用于其他指标的测定。第0、 7、14天早上8-10点收集小鼠粪便，将每只小鼠单独放置在干净的ivc笼盒中，及时收集小 鼠的粪便，记录粪便颗粒数，放置于冰盒中储存，冷冻干燥后记录粪便干重，粪便含水量采 用以下公式进行计算：粪便含水量(％)：(粪便湿重-粪便干重)
÷
粪便湿重
×
100％。第14 天检测小鼠首粒黑便时间，除了给空白对照组小鼠灌胃0.2ml生理盐水外，其余组小鼠灌胃 0.2ml洛哌丁胺，1h后给空白对照组以及便秘组小鼠灌胃0.25ml墨汁,长双歧杆菌 ccfm1077组、长双歧杆菌s7组和阳性药物对照组灌胃0.25ml含有各自灌胃内容物的墨汁， 将灌胃小鼠放置与铺有白色滤纸的干净的ivc笼具中，记录每只小鼠灌胃墨汁后排出第一粒 黑便的时间。
[0113]
由图9-11可知，长双歧杆菌ccfm1077组相对于便秘模型组，灌胃长双歧杆菌ccfm1077 组能显著增加粪便含水量、排便频率和肠道转运时间，其中灌胃长双歧杆菌ccfm1077后粪 便含水量可达62.8％，比便秘模型组提高了67％(p《0.0001)；灌胃长双歧杆菌ccfm1077后 在一定程度上缩短了肠道转运时间(167min)，比便秘模型组缩短了36.7％；灌胃长双歧杆菌 ccfm1077后排便频率显著降低(p《0.001)。同时与对照组(粪便含水量50.8％，肠道转运时 间
·
178min)相比，粪便含水量提高了23.7％，肠道转运时间降低了6.3％。且这三种表观指 标上，长双歧杆菌ccfm1077的作用效果要优于长双歧杆菌s7。综上所述，长双歧杆菌 ccfm1077从表观指标上凸显出了良好的缓解便秘作用。
[0114]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。