一种双歧杆菌的发酵方法及其应用

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种双歧杆菌的发酵方法及其应用。


背景技术：

2.双歧杆菌是人肠道中的一类常见细菌，是严格厌氧的革兰氏阳性菌，在成人肠道中约占总菌数的10％，在婴儿肠道中则是最优势的一类菌，约占母乳喂养婴儿肠道菌的91％和奶粉喂养婴儿肠道菌的75％。双歧杆菌与其它乳酸菌的区别在于它能利用独特的6-磷酸-果糖磷酸酮酶途径代谢葡萄糖，而且其dna的gc含量也显著高于其它乳酸菌。双歧杆菌(bifidobacterium,bfb)作为健康人肠道内定植数量占优势的益生菌，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌消炎、抗衰老和降血脂等一系列保健功能，其与许多病理和生理现象密切相关。
3.双歧杆菌作为人和动物肠道中最重要的生理性细菌之一，是目前微生态学研究的重心。传统对双歧杆菌的研究方法主要基于分离培养，moore和holdman等人的研究发现，双歧杆菌在人的粪便样品中含量较高，通常能分离到的双歧杆菌有：bifidobacterium adolescents，bifidobacterium infantes及bifidobacterium longum等。satokari等人用类群专一性的引物结合dgge方法对人粪便样品中的双歧杆菌的组成情况进行了分析，结果发现，双歧杆菌的组成具有个体特异性，且在4个月的动态监测时间段内保持稳定。b.adolescentis是人粪便样品中最常见的一类双歧杆菌。据文献报道，与人相关的双歧杆菌主要有以下12种：青春双歧杆菌(b.adolescentis)，婴儿双歧杆菌(b.infantis)，长双歧杆菌(b.longum)，两歧双歧杆菌(b.bifidum)，短双歧杆菌(b.breve)，链状双歧杆菌(b.catenulatum)，假小链双歧杆菌(b.pseudocatenulatum)，角双歧杆菌(b.angulatum)，高卢双歧杆菌(b.gallicum)，异形双歧杆菌(b.inopinatum)，齿双歧杆菌(b.dentium)和龋齿双歧杆菌(b.denticolens)，后3种主要发现于口腔。
4.目前，出于对益生菌活菌安全性的考虑，越来越多的研究开始关注非活性菌的益生菌成份对人体的有益作用，比如益生菌菌壁成份、热失活的益生菌菌体、益生菌代谢产物等，这些有益物质被称为“后生元”。而随着有研究发现在特定的培养环境和条件下，革兰氏阳性菌也可以分泌胞外囊泡，越来越多的研究开始关注双歧杆菌等益生菌产生的胞外囊泡，这些囊泡也属于“后生元”的一种。现有已有研究证明胞外囊泡在细菌与细菌之间、细菌与细胞之间的交流具有重要作用，双歧杆菌胞外囊泡也广泛应用于食品微生物学、食品科学、功能食品、保健品和制药等领域。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种双歧杆菌的发酵方法及其应用，通过在双歧杆菌的基础培养发酵剂中加入可食用植物源胞外囊泡，可以有效提高双歧杆菌胞外囊泡的产量。
6.第一方面，本发明提供一种提高双歧杆菌胞外囊泡产量的发酵方法，包括：在双歧杆菌的发酵培养基中加入可食用植物源胞外囊泡1～50mg/l。
7.进一步地，所述可食用植物源胞外囊泡包括：胡罗卜源胞外囊泡和/或西红柿源胞外囊泡。
8.进一步地，还包括硒离子盐；所述硒离子盐优选为亚硒酸钠。
9.进一步地，所述括硒离子盐的添加量为1～20μg/ml。
10.进一步地，所述可食用胡萝卜源胞外囊泡的含量为5～20mg/l；和/或，所述西红柿源胞外囊泡10-30mg/ml。进一步地，这两类囊泡可以同时使用，例如胡萝卜源胞外囊泡20mg/ml+西红柿源胞外囊泡30mg/ml。
11.进一步地，以重量份计，所述基础培养发酵剂包括：葡萄糖10～30份、蛋白胨5～20份、牛肉膏5～20份、酵母提取物1～10份、乙酸钠1～10份、磷酸氢二钠1～5份、柠檬酸氢二铵1～5份、吐温-80 0.1～2份、无水硫酸镁0.1～1份、一水合硫酸锰0.1～1份和l-半胱氨酸盐酸盐0.1～1份。
12.第二方面，本发明提供一种发酵剂添加物，包括：可食用植物源胞外囊泡和硒离子盐。
13.进一步地，所述可食用植物源胞外囊泡包括：胡罗卜源胞外囊泡和/或西红柿源胞外囊泡；所述可食用植物源胞外囊泡的含量为1～50mg/l，所述硒离子盐的含量为1～20μg/ml。
14.进一步地，所述可食用胡萝卜源胞外囊泡的含量为5～20mg/l；和/或，所述西红柿源胞外囊泡10-30mg/ml；和/或，所述硒离子盐的含量为5-20μg/ml。
15.第三方面，本发明提供一种提高双歧杆菌胞外囊泡抗氧化能力的方法，包括：在双歧杆菌的发酵培养基中添加所述发酵剂添加物。
16.本发明进一步提供所述发酵方法，或所述发酵剂添加物在提高双歧杆菌胞外囊泡产量中的应用。
17.本发明进一步提供所述发酵方法，或所述发酵剂添加物在提高双歧杆菌胞外囊泡抗氧化活性中的应用。
18.本发明进一步提供所述发酵方法，或所述发酵剂添加物在提高抗衰老能力中的应用。
19.本发明具备如下有益效果：
20.本发明在在改良培养发酵剂中特别添加了促生长因子可食用植物-胡萝卜源和/或西红柿源胞外囊泡和硒离子盐亚硒酸钠。其中，可食用植物-胡萝卜源和/或西红柿源胞外囊泡可以显著提高双歧杆菌胞外囊泡的产量，同时亚硒酸钠和食用植物源胞外囊泡(胡萝卜和/或西红柿源胞外囊泡)可以使得双歧杆菌胞外囊泡中富集更多的硒蛋白，提高双歧杆菌胞外囊泡的抗氧化能力。
21.本发明提供的方法可以用于工厂化大量生产双歧杆菌胞外囊泡，对于双歧杆菌胞外囊泡的应用具有重要的价值。
附图说明
22.图1为本发明实施例2提供的亚硒酸钠和可食用植物源外源囊泡对于双歧杆菌胞外囊泡产量的影响示意图。
23.图2为本发明实施例3提供的双歧杆菌和与胡萝卜或西红柿源胞外囊泡结合的检
测结果。
24.图3为本发明实施例4提供的0、5、10、20、30和50mg/l的胡萝卜或西红柿源胞外囊泡添加量对于双歧杆菌胞外囊泡的产量的影响示意图。
25.图4为本发明实施例5提供的亚硒酸钠以及胡萝卜或西红柿源胞外囊泡对于双歧杆菌胞外囊泡的抗脂质氧过氧化率的影响示意图。
26.图5为本发明实施例5提供的亚硒酸钠以及胡萝卜或西红柿源胞外囊泡对于双歧杆菌胞外囊泡的dpph自由基清除率的影响示意图。
27.图6为本发明实施例5提供的5、10、20、30ug/ml浓度亚硒酸钠对双歧杆菌胞外囊泡的清除dpph自由基效果示意图。
28.图7为本发明实施例6提供的亚硒酸钠和植物源胞外囊泡对长双歧杆菌bl的胞外囊泡在肠道屏障功能中的影响示意图。
29.图8为本发明实施例7提供的亚硒酸钠和植物源胞外囊泡对于双歧杆菌胞外囊泡抗衰老能力的影响示意图。
30.图9为本发明实施例8提供的亚硒酸钠、植物源胡萝卜或西红柿胞外囊泡对乳杆菌胞外囊泡产量和抗氧化效果影响示意图。
31.图10为本发明实施例9提供的在常规tpy培养基和mrs培养基中亚硒酸钠、植物源胡萝卜或西红柿胞外囊泡对于双歧杆菌胞外囊泡产量的影响示意图。
32.图11为本发明实施例9提供的在常规tpy培养基和mrs培养基中亚硒酸钠、植物源胡萝卜或西红柿胞外囊泡对于双歧杆菌胞外囊泡抗氧化效果的影响示意图。
具体实施方式
33.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
34.实施例1产囊泡双歧杆菌的初筛
35.本发明在实验室中已有的33株双歧杆菌中筛选出可以产生囊泡的双歧杆菌，得到3株可以产生囊泡的双歧杆菌，其中以长双歧杆菌bl作为研究对象。
36.实施例2双歧杆菌胞外囊泡的生产
37.1、改良培养发酵剂配比为：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1ml、无水硫酸镁0.58g、一水合硫酸锰0.25g、l半胱氨酸盐酸盐0.4g，添加蒸馏水定容至1l，调节ph至6.5-7.0，分装充氮后，121℃灭菌15min。其中额外添加无菌促生长因子胡萝卜源和/或西红柿源胞外囊泡1-50mg/l和硒离子盐亚硒酸钠1-20ug/ml。
38.2、上述植物源胡萝卜胞外囊泡的制备方法如下：
39.(1)均质：将新鲜胡萝卜或西红柿去皮洗净后放入高速搅拌机中，进行均质1分钟。
40.(2)过滤：通过抽真空抽滤机过滤后去除胡萝卜或西红柿固体，得到胡萝卜或西红柿汁液。
41.(3)离心：在4℃，将胡萝卜或西红柿汁液分别在2000g离心10分钟，5000g离,20分钟，10000g离心60分钟,然后在150000g条件下离心90分钟，加入无菌生理盐水重悬囊泡沉淀，-80℃储存备用。
42.3、双歧杆菌胞外囊泡的制备：
43.(1)发酵：按2
×
107cfu/ml接种量接种于上述改良培养发酵剂中，以不含有无菌促生长因子胡萝卜源或西红柿源胞外囊泡和不含有硒离子盐亚硒酸钠的改良培养发酵剂作为对照，37℃，48小时至od
600
＝1.5。
44.(2)离心：在4℃，将发酵液分别在5000g离心10分钟，10000g离心20分钟,上清液使用0.45μm过滤器过滤，然后在150000g条件下离心90分钟，最后加入无菌生理盐水重悬囊泡沉淀。
45.(3)胞外囊泡定量：使用nanosight ns300纳米颗粒分析仪对囊泡进行定量分析。
46.结果显示(图1)：与空白对照组相比，添加亚硒酸钠同时添加可食用植物-胡萝卜源胞外囊泡(20mg/l)(se-cnps)组、西红柿源胞外囊泡(30mg/l)(se-tnps)组和胡萝卜+西红柿源胞外囊泡(20+30mg/l)(se-c+tnps)组都可显著提高长双歧杆菌bl胞外囊泡产量，分别提高了192％、180％和203％。但是单独添加亚硒酸钠20ug/ml组与空白不添加亚硒酸钠组相比对长双歧杆菌bl胞外囊泡产量没有影响。
47.实施例3：双歧杆菌与胡萝卜或西红柿源胞外囊泡结合的鉴定
48.1、pkh26荧光染料试剂盒荧光标记胡萝卜或西红柿源胞外囊泡
49.在500ul无菌生理盐水重悬的胡萝卜或西红柿源胞外囊泡溶液中加入4ul sigma公司的pkh26荧光染料，室温避光染色30分钟，再加入500ul diluent c溶液室温避光反应10分钟。13000g离心5分钟，加入500ul无菌生理盐水重悬沉淀。
50.2、长双歧杆菌bl与胡萝卜源胞外囊泡结合鉴定
51.采用1
×
107个长双歧杆菌bl与1mgpkh26标记的胡萝卜源胞外囊泡一起室温培养30分钟，经无菌生理盐水清洗2遍后，在共聚焦显微镜下进行荧光拍摄。
52.结果显示(图2)：与空白对照组相比，添加pkh26标记的胡萝卜源胞外囊泡组长双歧杆菌bl上的荧光显著增高，证明胡萝卜源胞外囊泡可以被植物乳杆菌摄取并结合在一起。
53.实施例4：改良培养发酵剂中成分特性添加量及增产效果的确定
54.分别以0、5、10、20、30和50mg/l的胡萝卜和/或西红柿源胞外囊泡添加量进行实验，对比长双歧杆菌bl胞外囊泡的产量。
55.结果显示(图3)：胡萝卜源胞外囊泡最小的有效添加量为5mg/l,最大有效添加量为20mg/l；西红柿源胞外囊泡最小的有效添加量为10mg/l,最大有效添加量为30mg/l。
56.实施例5：改良培养发酵剂中植物源胞外囊泡和硒离子盐亚硒酸钠对比长双歧杆菌bl胞外囊泡抗氧化活性影响的测定
57.1、抗脂质过氧化试验
58.(1)反应体系组成为：亚油酸乳状液1ml、feso4(0.01％)0.2ml、h2o2(0.02％)0.2ml、pbs(0.02mol/l,ph7.4)1ml，总体积2.4ml，其中亚油酸乳状液由0.1ml亚油酸，0.2ml吐温20和19.7ml去离子水组成。
59.(2)按照上述反应体系加入样品，以普通培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡做为空白对照(nps)组，分别以改良培养发酵剂中添加亚硒酸钠(20ug/ml)(se-nps)组、添加亚硒酸钠和胡萝卜源胞外囊泡(20mg/l)(se-cnps)组、添加亚硒酸钠和西红柿源胞外囊泡(30mg/l)(se-tnps)组、添加亚硒酸钠和植物源胞外囊泡(胡萝卜源胞外囊泡20mg/l、西红柿源胞外囊泡30mg/l)(se-c+tnps)组培养后的长双歧杆菌bl胞外囊泡作为实验组，分
别以上述长双歧杆菌bl胞外囊泡浓度为20ug/ml剂量添加样品。
60.在37℃条件反应12h后，加入三氯乙酸(4％)0.2ml、硫代巴比妥酸(0.8％)2ml、2,6-二叔丁基对甲酚(0.4％)0.2ml,充分混合后在100℃反应30min，然后冷却。最后离心，上清液于比色皿中用分光光度计测532nm处的吸光值。
61.抗脂质过氧化率(％)＝[1－a
532
(样品)/a
532
(空白)]
×
100
[0062]
结果显示(图4)：添加亚硒酸钠可以显著增加长双歧杆菌bl胞外囊泡的抗脂质氧过氧化率，在富硒条件下再加入植物源胡萝卜胞外囊泡可以显著增强长双歧杆菌bl胞外囊泡的抗脂质氧过氧化率，但是添加西红柿源胞外囊泡效果不显著。与se-nps组相比，以在富硒条件下同时添加胡萝卜源胞外囊泡20mg/l和西红柿源胞外囊泡30mg/l可以显著的增加抗脂质过氧化率。
[0063]
2、清除dpph自由基能力试验
[0064]
以普通空白培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡做为空白对照(nps)组，分别以改良培养发酵剂中添加亚硒酸钠(20ug/ml)(se-nps)组、添加亚硒酸钠和胡萝卜源胞外囊泡(20mg/l)(se-cnps)组、添加亚硒酸钠和西红柿源胞外囊泡(30mg/l)(se-tnps)组、添加亚硒酸钠和植物源胞外囊泡(胡萝卜源胞外囊泡20mg/l、西红柿源胞外囊泡30mg/l)(se-c+tnps)组培养后的长双歧杆菌bl胞外囊泡作为实验组。
[0065]
以上述长双歧杆菌bl胞外囊泡浓度为20ug/ml剂量添加样品，用pbs补足至2.0ml，然后加入3.0ml 0.1mmol/l dpph溶液(95％乙醇)混合，用力摇匀，于室温避光反应30min，离心，上清液于517nm处测定吸光值。以200μg/l的抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(bht)作为阳性对照。
[0066]
dpph自由基清除率(％)＝[1－a
517
(样品)/a
517
(空白)]
×
100
[0067]
式中，a
517
(样品)为样品组反应后的吸光值；a
517
(空白)为空白对照组反应后的吸光值。结果显示(图5)：添加亚硒酸钠可以显著增加长双歧杆菌bl胞外囊泡的dpph自由基清除率率，在富硒条件下加入植物源胡萝卜源胞外囊泡可以增强长双歧杆菌bl胞外囊泡的dpph自由基清除率，与se-nps组相比，se-c+tnps组的长双歧杆菌bl胞外囊泡dpph自由基清除率显著增加。
[0068]
3、不同浓度亚硒酸钠对长双歧杆菌bl的胞外囊泡抗氧化能力的鉴定
[0069]
以普通空白培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡做为空白对照(nps)组，分别以改良培养发酵剂中添加亚硒酸钠5、10、20、30ug/ml浓度培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡作为实验组。
[0070]
按照上述方法测量清除dpph自由基实验。
[0071]
结果显示(图6)：5ug/ml亚硒酸钠浓度为最小有效增加长双歧杆菌bl胞外囊泡清除dpph自由基的添加浓度，20ug/ml浓度为最大有效增加长双歧杆菌bl胞外囊泡清除dpph自由基效果。
[0072]
实施例6：添加亚硒酸钠和植物源胞外囊泡对长双歧杆菌bl的胞外囊泡在肠道屏障功能中的影响鉴定
[0073]
1、测定肠上皮细胞的单层细胞跨膜电阻值(teer)
[0074]
(1)以普通空白培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡作为对照(nps)组，分别以改良培养发酵剂中添加亚硒酸钠(20ug/ml)(se-nps)组、添加亚硒酸钠和胡萝卜源胞外
囊泡(20mg/l)(se-cnps)组、添加亚硒酸钠和西红柿源胞外囊泡(30mg/l)(se-tnps)组、添加亚硒酸钠和植物源胞外囊泡(胡萝卜源胞外囊泡20mg/l、西红柿源胞外囊泡30mg/l)(se-c+tnps)组培养后的长双歧杆菌bl胞外囊泡作为实验组。
[0075]
(2)选用肠上皮细胞caco-2细胞，以2x105个/ml密度进行铺板，培养2周形成单层细胞。连续培养5天，每天以1x108个/ml浓度添加上述长双歧杆菌bl胞外囊泡到caco-2细胞中，然后测量teer电阻阻值。
[0076]
结果显示(图7)：与空白对照(nps)组相比，添加亚硒酸钠可以显著增加teer电阻阻值。在富硒条件下，添加植物源-胡萝卜胞外囊泡组可以显著增加caco-2细胞的teer电阻阻值，但是添加西红柿源胞外囊泡对caco-2细胞的teer电阻阻值没有显著影响。
[0077]
实施例7：改良培养发酵剂中添加亚硒酸钠和植物源胞外囊泡培养的的长双歧杆菌bl胞外囊泡对抗衰老能力的鉴定
[0078]
以秀丽隐杆线虫(c.elegans)进行实验，新出生的(第0天)线虫在op50培养皿中培养至成熟，然后分别转移到op50对照组，op50+长双歧杆菌bl胞外囊泡(op50+nps)组，op50+亚硒酸钠培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡(op50+se-nps)组,op50+亚硒酸钠+胡萝卜源胞外囊泡培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡(op50+se-cnps)组，op50+亚硒酸钠+胡萝卜和西红柿源胞外囊泡培养发酵剂培养的长双歧杆菌bl胞外囊泡(op50+se-c+tnps)组，在以上培养皿中进行培养。每组包含线虫20只，在20℃条件下进行孵育。这些蠕虫每隔一天转移到新的培养皿上。活的或死的线虫数量在每天转移时进行计算。
[0079]
成活率计算为存活的线虫/线虫总数的百分比。由于被粘在平板壁上而导致线虫死亡的情况被排除在分析之外。寿命评估至少进行了三次。
[0080]
结果显示(图8)：与空白对照op50组相比，添加长双歧杆菌bl胞外囊泡(nps)可以显著增加线虫的最长平均寿命。在生物富硒条件下可以有效放大长双歧杆菌bl胞外囊泡(nps)增加线虫的最长平均寿命的有益效果。与(se-nps)组相比，添加植物源胡萝卜胞外囊泡(se-cnps)组和胡萝卜+西红柿胞外囊泡(se-c+tnps)组可以显著延长线虫的最长平均寿命。本实验表明在改良培养基中添加亚硒酸钠和植物源胞外囊泡能显著增加长双歧杆菌bl胞外囊泡(nps)在抗衰老能力上的作用。
[0081]
实施例8
[0082]
本实施例验证添加亚硒酸钠、植物源胡萝卜和/或西红柿胞外囊泡对其他细菌胞外囊泡产量和抗氧化效果的影响
[0083]
以普通空白培养发酵剂作为空白对照(lnps)组，分别以添加亚硒酸钠(20ug/ml)(se-lnps)组，添加亚硒酸钠同时添加添加胡萝卜源胞外囊泡(20mg/l)(se-clnps)组、西红柿源胞外囊泡(30mg/l)(se-tlnps)组、胡萝卜源胞外囊泡20mg/l+西红柿源胞外囊泡30mg/l(c+tlnps)组培养培养植物乳杆菌。
[0084]
结果显示(图9)：与空白对照(lnps)组相比，添加亚硒酸钠、植物源胡萝卜或西红柿胞外囊泡均不能增加植物乳杆菌胞外囊泡产量和抗氧化效果。
[0085]
实施例9
[0086]
本实施例采用其他常规培养基，添加关键营养成份亚硒酸钠、植物源胡萝卜和/或西红柿胞外囊泡对长双歧杆菌bl胞外囊泡产量和抗氧化效果鉴定
[0087]
采用常规tpy培养基和mrs培养基进行实验，分为空白对照(control)组、添加亚硒
酸钠(20ug/ml)+胡萝卜源胞外囊泡(20mg/l)+西红柿源胞外囊泡(30mg/l)(se+c+t)组，按以上分组培养长双歧杆菌bl，并获得长双歧杆菌bl胞外囊泡进行胞外囊泡产量和抗氧化效果鉴定。
[0088]
结果显示(图10和图11)：在常规tpy培养基和mrs培养基中，与空白对照(control)组相比，se+c+t组可以显著增加长双歧杆菌bl胞外囊泡产量和抗氧化效果。
[0089]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。