一种乳酸片球菌SEUNEU-106及其在皮肤方面的应用的制作方法

一种乳酸片球菌seuneu-106及其在皮肤方面的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体为一种乳酸片球菌seuneu-106及其在皮肤方面的应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，它覆盖于肌肉组织表面，将人体内部组织结构同外界隔绝开来，为人体内部组织和器官提供一个稳定安全的环境，保证人体内部不遭受外界环境的伤害；伴随时间的延长，皮肤难免会遭受来自不同有害因素的影响，使其组织细胞遭受损伤活力降低，生理功能下降，皮肤基本健康问题遭到威胁，体现在外观就会引发皮肤屏障受损以及皮肤炎症反应。
3.目前，益生菌在人类生活中用途很多，覆盖领域非常广泛，包括传统的工业发酵领域、食品领域、医药领域，近年来开始在应用于皮肤健康领域，中国专利cn202110508277.5中提供了一种副干酪乳杆菌及其发酵液，用于皮肤外用涂覆，主要目的为增加皮肤弹性以及消除自由基，使其发挥美白、抗衰等功能性作用，而并非解决包括皮肤屏障受损以及皮肤炎症反应的皮肤基本健康问题；需知在护肤金字塔中，一切用于美化的功能性作用都应该是以维护皮肤基本健康为前提的。因此维护皮肤基本健康，修复受损皮肤屏障，抵抗皮肤炎症反应，开发新的益生菌资源具有非常大的实际意义。


技术实现要素：

4.本技术发明人经大量实验从10岁健康男孩粪便中筛选到了一株具有优异益生菌功能的乳酸片球菌，经过大量实验证实，该乳酸片球菌菌株对皮肤屏障有良好的修护效果，并且能够抵抗皮肤炎症反应。
5.因此，第一方面，本技术提供了一种乳酸片球菌，其分类名为pediococcus acidilactici，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20211437。
6.优选的，所述乳酸片球菌的菌株为经间歇灭菌的，其生理状态包括活的或死的。
7.第二方面，本技术提供了一种乳酸片球菌在皮肤方面的应用，所述乳酸片球菌具有皮肤修复功能，实现方式包括食品用途、药品用途以及化妆品用途。
8.优选的，具有皮肤修复功能的乳酸片球菌，其菌株来源包括其培养上清液以及灭活菌株。
9.进一步的，所述培养上清液的制备方法包括：
10.(1)将生理盐水处理后的样品接种于mrs固体培养基上进行培养，生理盐水维持了样品细胞的正常形态，保证后续操作正常进行；
11.(2)培养完成后筛选生长均匀地单个菌落，将其置于mrs肉汤中进行37℃恒温培养过夜，得到长势良好且生理特性清晰的标准菌株；
12.(3)将培养完成的mrs肉汤培养基用酶标仪检测od600值，稀释培养基到od600＝0.2；
13.(4)将稀释后的培养基进行离心，获取上清液，得到所需具备皮肤修复能力的菌体。
14.进一步的，所述灭活菌株的制备方法包括：
15.(1)将生理盐水处理后的样品接种于mrs固体培养基上进行培养，生理盐水维持了样品细胞的正常形态，保证后续操作正常进行；
16.(2)培养完成后筛选生长均匀地单个菌落，将其置于mrs肉汤中进行37℃恒温培养过夜，得到长势良好且生理特性清晰的标准菌株；
17.(3)将培养完成的mrs肉汤培养基进行离心，弃掉上清液获得菌体；
18.(4)用酶标仪检测所得菌体od600值，在培养基中加入pbs缓冲液适当稀释，pbs缓冲液具有盐平衡、可调整的适宜ph缓冲作用，至酶标仪检测od600＝0.2；
19.(5)将稀释完成的菌体进行121℃高压30min灭活，即得灭活菌株，所的菌株具备皮肤修复的能力。
20.进一步的，所述乳酸片球菌其皮肤修复功能为对hacat细胞十二烷基硫酸钠损伤具有修复作用。
21.进一步的，所述乳酸片球菌其皮肤修复功能为促进hacat细胞屏障修复相关基因表达。
22.进一步的，所述乳酸片球菌其皮肤修复功能为降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量。
23.进一步的，所述乳酸片球菌其皮肤修复功能为下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat炎性因子il-8基因表达。
24.与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
25.本发明提供了一种乳酸片球菌，其分类名为pediococcus acidilactici，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m20211437；所述乳酸片球菌具有皮肤修复功能，包括对十二烷基硫酸钠损伤的hacat细胞具有修复作用、促进hacat细胞屏障修复相关基因表达、降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量、下调金黄色葡萄球菌诱导的hacat炎性因子il-8基因表达；所述乳酸片球菌具有皮肤修复功能，其实现方式包括食品用途、药品用途以及化妆品用途。
附图说明
26.图1为乳酸片球菌seuneu-106促进hacat细胞修复效果图
27.图2为乳酸片球菌seuneu-106上清液上调屏障修护相关基因表达效果图
28.图3为乳酸片球菌seuneu-106灭活菌体上调屏障修护相关基因表达
具体实施方式
29.以下结合实施例对本发明做进一步的说明，应当理解，本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外,为了更好地说明本发明的内容，本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本发明同样可以实施。在另外一些实施例中,对于本领域技术人员熟知的方法、手段未作详细描述,以便于凸显本发明的主旨。
30.实施例一：
31.本技术从10岁健康男孩粪便中采取样本，分离筛选出了一株乳酸片球菌，将其命名为乳酸片球菌seuneu-106。
32.菌株的分离：
33.(1)于10岁健康男孩粪便中采样，获得一种乳酸片球菌；
34.(2)将所得乳酸片球菌置于生理盐水中震荡混匀，生理盐水可维持乳酸片球菌固有细胞形态，不至于破坏细胞；
35.(3)混匀后取少量上清液在固体培养基上对乳酸片球菌进行划线接种培养，设置恒定温度37℃培养48h；
36.(4)培养完成后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，即为乳酸片球菌seuneu-106。
37.(5)对所得乳酸片球菌进行革兰氏染色镜检，结果如下：所得乳酸片球菌菌株为革兰氏阳性，在显微镜下成球状；在mrs固体培养基上可形成白色、表面光滑圆润不透明的圆形小军萝，边缘整齐；在mrs液体培养基中则呈均匀混浊生长，久置菌体则形成白色沉淀。
38.菌株的核酸鉴定：
39.(1)挑取上述单个菌落，置于mrs液体培养基中进行37℃恒温培养，过夜；
40.(2)培养完成后对培养基进行离心，收集菌体；
41.(3)对收集得到的菌体进行核酸提取，提取过程按照dna提取试剂盒步骤进行，所用引物为27f,1492r；
42.(4)对得到的核酸片段进行pcr扩增和延伸；pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；设置94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；恒定温度72℃延伸10min；
43.(5)对所得扩增产物进行测序处理，测序完成后将结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出seuneu-106菌株为乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)。
44.乳酸片球菌seuneu-106培养上清液的制备：
45.(1)将生理盐水处理后的样品接种于mrs固体培养基上进行培养，生理盐水维持了样品细胞的正常形态，保证后续操作正常进行；
46.(2)培养完成后筛选生长均匀地单个菌落，将其置于mrs肉汤中进行37℃恒温培养过夜，得到长势良好且生理特性清晰的标准菌株；
47.(3)将培养完成的mrs肉汤培养基用酶标仪检测od600值，稀释培养基到od600＝0.2；
48.(4)将稀释后的培养基进行12000转离心2min，获取上清液，得到所需具备皮肤修复能力的菌体。
49.乳酸片球菌seuneu-106灭活菌株的制备：
50.(1)将生理盐水处理后的样品接种于mrs固体培养基上进行培养，生理盐水维持了样品细胞的正常形态，保证后续操作正常进行；
51.(2)培养完成后筛选生长均匀地单个菌落，将其置于mrs肉汤中进行37℃恒温培养过夜，得到长势良好且生理特性清晰的标准菌株；
52.(3)将培养完成的mrs肉汤培养基进行12000转离心2min，弃掉上清液获得菌体；
53.(4)用酶标仪检测所得菌体od600值，在培养基中加入pbs缓冲液适当稀释，pbs缓
冲液具有盐平衡、可调整的适宜ph缓冲作用，至酶标仪检测od600＝0.2；
54.(5)将稀释完成的菌体进行121℃高压30min灭活，即得灭活菌株，所的菌株具备皮肤修复的能力。
55.乳酸片球菌seuneu-106促进hacat细胞修复实验
56.(1)在96孔细胞培养板上接种一定量hacat细胞，过夜培养至细胞贴壁；
57.(2)在96孔培养板的每个孔中各加入50μg/ml十二烷基硫酸钠100μl，所用十二烷基硫酸钠具有生物降解的作用，会对所用hacat细胞产生损伤，将其与培养的hacat细胞混合培养8h；
58.(3)培养完成后将产物分别与5％上清液和10％灭活菌体混合培养24h，同时两类实验各设置三组平行试验作为对照，提高实验数据的准确度；
59.(4)孵育完成后加入10μl的cck-8溶液，孵育4h，用酶联免疫检测仪检测450nm处吸光值，所得吸光值可间接反映活细胞的数量。
60.实验结果如下表：
61.seuneu-106促进hacat细胞修复
[0062][0063]
通过三组平行试验数据可知乳酸菌其上清液及灭活菌体提高了hacat细胞的存活率，对十二烷基硫酸钠sds损伤的hacat细胞具有修复作用。
[0064]
实施例二：
[0065]
乳酸片球菌seuneu-106的分离、核酸鉴定、上清液以及灭活菌体的制备，实验操作均与实施例一中的方法相同，操作结束即获得具有皮肤修复能力的乳酸片球菌的培养上清液和灭活菌株。
[0066]
乳酸片球菌seuneu-106对细胞屏障修护相关基因表达的调控实验
[0067]
(1)在96孔细胞培养板上接种一定量hacat细胞，过夜培养至细胞贴壁；
[0068]
(2)将所得细胞培养产物与5％培养上清液以及10％灭活菌体，分别混合培养24h，同时两类实验各设置三组平行试验作为对照，提高实验数据的准确度；
[0069]
(3)培养结束后加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，并反转录为cdna，进行qpcr测定细胞屏障修护相关基因flg、ivl、ovol1、lor的表达。
[0070]
实验结果如下表：
[0071]
seuneu-106上清液上调屏障修护相关基因表达
[0072]
seuneu-106灭活菌体上调屏障修护相关基因表达
[0073][0074][0075]
需知基因表达变化倍数f＝2-δδct
；从表中数据可知乳酸菌seuneu-106其培养上清液和灭活菌株能够上调屏障修护相关基因的表达，具有促进皮肤屏障修护的作用。
[0076]
实施例三：
[0077]
乳酸片球菌seuneu-106的分离、核酸鉴定、上清液以及灭活菌体的制备，实验操作均与实施例一中的方法相同，操作结束即获得具有皮肤修复能力的乳酸片球菌的培养上清液和灭活菌株。
[0078]
乳酸片球菌seuneu-106降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量的实验
[0079]
(1)在24孔细胞培养板上接种一定量经过细胞消化后的raw264.7细胞，将其置于5％二氧化碳培养箱中保持37℃恒温培养过夜。
[0080]
(2)将培养后的raw264.7细胞与5％上清液以及10％灭活菌体分别混合培养，同时两类实验各设置三组平行试验作为对照，提高实验数据的准确度；
[0081]
(3)在所得各混合液中分别加入0.5ml的0.2μg/ml的lps溶液培养20h，诱导raw264.7细胞发炎；
[0082]
(4)培养完成后通过no含量检测试剂盒测定所得细胞培养上清液的no含量，每次3个复孔，共进行三批实验。
[0083]
实验结果如下表：
[0084]
seuneu-106降低raw264.7细胞no生成量
[0085]
[0086]
三组平行试验数据可知与lps对照组相比培养上清液降低raw264.7细胞no生成量24.70％，灭活菌体降低raw264.7细胞no生成量28.11％；以此说明乳酸片球菌seuneu-106能够降低lps诱导的raw264.7细胞no生成量，对lps诱导的raw264.7细胞炎症反应具有抵抗作用。
[0087]
实施例四：
[0088]
乳酸片球菌seuneu-106的分离、核酸鉴定、上清液以及灭活菌体的制备，实验操作均与实施例一中的方法相同，操作结束即获得具有皮肤修复能力的乳酸片球菌的培养上清液和灭活菌株。
[0089]
乳酸片球菌seuneu-106下调hacat细胞炎性因子表达的实验
[0090]
(1)在24孔细胞培养板上接种一定量消化后的hacat细胞，将其置于5％二氧化碳培养箱中37℃恒温培养过夜；
[0091]
(2)将金黄色葡萄球菌接种至营养肉汤培养基上，设置37℃摇床培养过夜；
[0092]
(3)在所得金黄色葡萄球菌菌液中加入mem无血清培养基，调整其浓度至od600＝6；
[0093]
(4)在培养过后的hacat细胞培养板上各孔各添加100μl的od600＝6的金黄色葡萄球菌菌液，培养3h，刺激hacat细胞产生炎症因子；
[0094]
(5)培养完成后弃掉细胞培养基，用pbs缓冲液清洗所得hacat细胞培养产物5次，每孔重新加入1ml的mem无血清培养基；
[0095]
(6)在所得hacat细胞培养液中加入5％的乳酸片球菌seuneu-106培养上清液，每组3个复孔，37℃恒温培养过夜。
[0096]
(7)将所得培养产物弃掉培养基，用rna提取试剂盒提取rna，检测rna浓度及纯度，将所有样品调整至1μg，用反转录试剂盒和sybrgreen qpcr试剂盒进行rt-pcr及qpcr，计算炎症因子基因相对表达倍数f＝2-δδct
。
[0097]
实验结果如下表：
[0098]
seuneu-106上清液下调炎症因子基因的表达
[0099][0100]
所得实验数据显示乳酸片球菌seuneu-106培养上清液下调了金黄色葡萄球菌诱导的hacat细胞炎性因子il-8基因的表达，使其表达量降低了46.18％，以此说明乳酸片球菌seuneu-106对金黄色葡萄球菌引发的hacat细胞得炎症反应具有抵抗作用。
[0101]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。