一种TaqDNA聚合酶单克隆抗体及其应用的制作方法

一种taq dna聚合酶单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种taq dna聚合酶单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.pcr检测是分子诊断的一种重要手段。pcr检测过程中临床样本种类众多，有些病原体样本不仅目的基因浓度低而且富含抑制物，其中唾液、痰液、鼻咽拭子、血液等对反应就有较强抑制性，常常导致扩增困难。日常检验中，具有较高灵敏度和特异性的检测试剂有利于低浓度样本的检出及pcr反应非特异性扩增的降低，从而减少检验过程中假阳性假阴性，提高实验结果的可信度。实验人员常通过优化反应体系中引物探针、退火温度、镁离子浓度等提高pcr检测的灵敏度和特异性，但操作复杂，费时费力。
3.目前常用热启动pcr法提高试剂的稳定性和特异性，常温下配制反应液或者等待上机时抗体与dna聚合酶特异性结合，防止非特异性扩增及引物二聚体的形成，pcr开始时抗体在高温变性步骤中失活，聚合酶解离出来恢复活性。
4.市场上常用的聚合酶单克隆抗体多适用于普通样本的检测，主要用于提高易扩样本检测的特异性等。鉴于临床检验中多富含抑制物的复杂样本如唾液等，因此，有必要开发一种针对taq dna聚合酶(抗逆酶)的taq dna聚合酶单克隆抗体。


技术实现要素：

5.本发明第一方面的目的，在于提供一种taq dna聚合酶单克隆抗体。
6.本发明第二方面的目的，在于提供编码本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体的核酸分子。
7.本发明第三方面的目的，在于提供包含本发明第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。
8.本发明第四方面的目的，在于提供杂交瘤细胞株。
9.本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体的制备方法。本发明第六方面的目的，在于提供一种热启动酶。
10.本发明第七方面的目的，在于提供本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞系、本发明第四方面的杂交瘤细胞株和/或第六方面的热启动酶在制备pcr试剂盒或pcr扩增中的应用。
11.本发明第八方面的目的，在于提供一种试剂盒。
12.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
13.本发明的第一个方面，提供一种taq dna聚合酶单克隆抗体；
14.所述taq dna聚合酶单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区；
15.所述重链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
16.所述重链可变区的cdr1的氨基酸序列为：
17.a)dygvt(seq id no.5)；或
18.b)与seq id no.5所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列；
19.所述重链可变区的cdr2的氨基酸序列为：
20.a)viwgggstfynstlks(seq id no.6)；或
21.b)与seq id no.6所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列；
22.所述重链可变区的cdr3的氨基酸序列为：
23.a)lelgrgyfdy(seq id no.7)；或
24.b)与seq id no.7所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列；
25.所述轻链可变区包含cdr1、cdr2、cdr3；
26.所述轻链可变区的cdr1的氨基酸序列为：
27.a)rasksvstsgysymh(seq id no.8)；或
28.b)与seq id no.8所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列；
29.所述轻链可变区的cdr2的氨基酸序列为：
30.a)lvsnles(seq id no.9)；或
31.b)与seq id no.9所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列；
32.所述轻链可变区的cdr3的氨基酸序列为：
33.a)qhir(seq id no.10)；或
34.b)与seq id no.10所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
35.优选地，所述重链可变区的氨基酸序列为：
36.a)evhlvesgpglvapsqslsitctvsgfsltdygvtwirqppgrglewlgviwgggstfynstlksrlsvskdnsksqvflrmnslqsddtamyycaklelgrgyfdywgqgttltvssaktt(seq id no.2)；或
37.b)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列；
38.所述轻链可变区的氨基酸序列为：
39.a)diqmiqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpsws(seq id no.1)；或
40.b)与seq id no.1所示的氨基酸序列具有95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列。
41.优选地，所述taq dna聚合酶单克隆抗体由于2021年6月3日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2021152的杂交瘤细胞株f10-6a5分泌得到。
42.本发明的第二个方面，提供编码本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体的核酸分子。
43.优选地，所述核酸分子包含编码所述taq dna聚合酶单克隆抗体的重链可变区的核酸分子a和编码所述taq dna聚合酶单克隆抗体的轻链可变区的核酸分子b；
44.所述核酸分子a的核苷酸序列如seq id no.4所示；
45.所述核酸分子b的核苷酸序列如seq id no.3所示。
46.本发明的第三个方面，提供包含本发明第二方面的核酸分子的表达盒、重组载体或转基因细胞系。
47.优选地，所述转基因细胞系不包含动植物品种。
48.本发明的第四个方面，提供杂交瘤细胞株，名称为杂交瘤细胞株f10-6a5，于2021年6月3日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2021152。
49.本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体的制备方法，
50.a)培养本发明第三方面的转基因细胞系得到；或
51.b)由本发明第四方面的杂交瘤细胞株分泌得到。
52.本发明的第六个方面，提供一种热启动酶，包含本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体和taq dna聚合酶。
53.优选地，所述taq dna聚合酶单克隆抗体和taq dna聚合酶的质量比为(1～3)：1。
54.优选地，所述taq dna聚合酶的氨基酸序列为野生型taq dna聚合酶的氨基酸序列(序列号：wp_156303260)突变3个氨基酸(g59w/v155i/e507k)后的氨基酸序列。
55.本发明的第七个方面，提供本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体、本发明第二方面的核酸分子、本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞系、本发明第四方面的杂交瘤细胞株和/或第六方面的热启动酶的应用。
56.(a1)～(a5)中任一种在制备pcr试剂盒中的应用；
57.(a1)本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体；
58.(a2)本发明第二方面的核酸分子；
59.(a3)本发明第三方面的表达盒、重组载体或转基因细胞系；
60.(a4)本发明第四方面的杂交瘤细胞株；
61.(a5)本发明第六方面的热启动酶。
62.(a1)或(a5)在pcr扩增中的应用；
63.(a1)本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体；
64.(a5)本发明第六方面的热启动酶。
65.本发明的第八个方面，提供一种试剂盒，包含：(a1)或(a5)；
66.(a1)本发明第一方面的taq dna聚合酶单克隆抗体；
67.(a5)本发明第六方面的热启动酶；
68.所述试剂盒还包含：逆转录酶、dntps、pcr缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
69.本发明的有益效果是：
70.本发明提供了一种taq dna聚合酶单克隆抗体，其对taq dna聚合酶具有良好的封闭效果，在37℃和55℃条件下可以很好地对taqdna聚合酶活性进行封闭，而在94℃的pcr变
性条件下失活，释放taq dna聚合酶活性，减少低温下的非特异性扩增；同时，包含taq dna单克隆抗体的热启动酶具有更好的扩增效率和灵敏度，检测灵敏度为1.5copies，高于现有技术的灵敏度(1000copies)；并且包含taq dna单克隆抗体的热启动酶反复冻融后或置于37℃存放7天不影响其检测效果，具有很好的稳定性，对使用和运输等过程中短期偏离正常保存条件具有重要意义。
附图说明
71.图1是实施例1中taq dna聚合酶(抗逆酶)的sds-page图。
72.图2是实施例1中taq dna聚合酶(抗逆酶)的westernblot结果图。
73.图3是实施例1中taq dna聚合酶(抗逆酶)扩增a型流感病毒基质蛋白基因片段的产物的琼脂糖电泳图。
74.图4是实施例1中taq dna聚合酶(抗逆酶)单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)的电泳图。
75.图5是实施例3中taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)的western blot结果图。
76.图6是实施例4中taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)分别与taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶(抗逆抗体酶)对唾液样本的扩增效果图。
77.图7是实施例5中taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶与市售热启动酶对唾液样本的扩增效果图。
78.图8是实施例6中taq dna聚合酶单克隆抗体6a5及普通抗体分别与taq dna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶对唾液样本的扩增效果图。
79.图9是实施例7中taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶经不同次数反复冻融后的扩增效果检测结果图。
80.图10是实施例7中taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶在不同条件下保存不同时间后的扩增效果检测结果图。
81.图11是实施例8中taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶及taq dna聚合酶(抗逆酶)分别配制的反应液的相对荧光值随时间变化曲线图，其中抗逆酶37℃与55℃的荧光变化曲线重合。
82.图12是实施例8中taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶的对低浓度样本扩增产物的电泳结果图。
具体实施方式
83.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
84.应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
85.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
86.实施例1 taq dna聚合酶单克隆抗体的制备
87.使用杂交瘤技术产生taq dna聚合酶单克隆抗体，具体如下：
88.1)免疫原的制备：根据ncbi野生型taq dna聚合酶的蛋白序列(序列号：wp_
156303260)，突变其中三个氨基酸g59w/v155i/e507k后得到taq dna聚合酶(抗逆酶)，将突变后的taq dna聚合酶(抗逆酶)的基因连接至原核表达载体pet28a中，经iptg诱导表达。菌体经超声波破碎后上清用75℃热失活后再过镍柱纯化，20mm咪唑洗涤杂蛋白，收集200mm咪唑洗脱下来的蛋白，洗脱产物用硫酸铵沉淀后透析过deae柱，蛋白洗脱峰进行sds-page鉴定，结果如图1所示：所得到的蛋白的大小与预期大小吻合，即为免疫原
‑‑
taq dna聚合酶(抗逆酶)，目的蛋白置于-80℃保存待用。
89.2)免疫原的westernblot鉴定：将1)得到的免疫原
‑‑
taq dna聚合酶(抗逆酶)进行sds-page电泳，通过半干转膜仪将目的蛋白转移至nc膜上，nc膜用5％脱脂奶粉封闭0.5h，随后以抗his单抗(免疫原
‑‑
taq dna聚合酶(抗逆酶)的n端带6个his组成的标签)作为一抗孵育2h，羊抗鼠igg-hrp为二抗孵育0.5h，经ecl发光试剂盒显色后，结果如图2所示：可见一条与目的蛋白分子量大小一致的清晰条带。
90.3)免疫原的pcr鉴定：以购自promega的taq dna聚合酶(货号m1661s，加入量为0.3ul)为对照，分别取0.1、0.3、0.5ul 5u/ul的免疫原
‑‑
taq dna聚合酶对a型流感病毒基质蛋白基因(登录号：mn055338.1)进行pcr扩增，扩增产物进行琼脂糖电泳，结果如图3所示：免疫原
‑‑
taq dna聚合酶可以对a型流感病毒基质蛋白基因进行特异性扩增，表明其具有dna聚合酶活性。
91.4)用上述经鉴定过的免疫原免疫小鼠，制备单克隆抗体：用免疫原对小鼠进行初次免疫及两次加强免疫，制备脾脏细胞，并将其与处于生长对数期的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，获得杂交瘤细胞。将上述所得杂交瘤细胞经过有限稀释法进行单克隆，再通过间接eli sa筛选出20株较优阳性单克隆细胞株。单克隆后的细胞经注射入弗氏不完全佐剂预免的小鼠腹腔，诱导产生腹水，腹水经protein a亲和柱纯化得到单克隆抗体，其中f10-6a5、f10-3f6、f10-5g1细胞株产生的单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)电泳结果如图4所示。其中f10-6a5细胞株，名称为杂交瘤细胞株f10-6a5，于2021年6月3日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c2021152。
92.实施例2 elisa检测所得腹水效价及灵敏度
93.1)腹水效价：实施例1中得到的免疫原
‑‑
taq dna聚合酶用碳酸盐缓冲液稀释作为包被液，包被96孔板，100ng/孔，37℃热孵1.5h，孵育完毕后pbs-t洗板1次；加入实施例1中得到的不同单克隆细胞株(f10-6a5、f10-3f6、f10-5g1)诱导产生的腹水(经样本稀释液稀释不同倍数，空白对照组加入样本稀释液，样本稀释液为含1v/v％bsa的pbs溶液)，100ul/孔，37℃孵育30min，孵育完毕后pbs-t洗板5次；酶标稀释液将hrp标记抗体(羊抗鼠igg-hrp)稀释1000倍，100μl/孔；37℃孵育30min；孵育完毕后pbs-t洗板5次；tmb显色，a液：b液＝1：1，现配现用；100μl/孔，37℃孵育15min；加入终止液，50μl/孔，终止显色反应，检测吸光度，结果如表1所示：单克隆细胞株(f10-6a5、f10-3f6、f1 0-5g1)诱导产生的腹水的效价均在400万以上，表明腹水中包含具有较高灵敏度和特异性的taq dna聚合酶抗体。
94.表1腹水效价检测结果
[0095][0096]
2)灵敏度测定：将纯化后的taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)与商品化抗体(taq-ab对照，购自takara，货号9002a)同时对不同稀释浓度抗原做elisa检测灵敏度，taq dna聚合酶(抗逆酶)用碳酸盐包被液倍比稀释后包被96孔板(稀释梯度分别为100ng、50ng、25ng、12.5ng、6.25ng、3.125ng，100ul/孔)，37℃热孵2h，孵育完毕后pbs-t洗板1次；加入上述四种taq dna聚合酶单克隆抗体(浓度为1mg/ml的单抗用样本稀释液按1：1000稀释)，37℃孵育30min，设置空白对照(只加入样本稀释液，100ul/孔)；孵育完毕后，pbs-t洗板5次；酶标稀释液将hrp标记抗体(羊抗鼠igg-hrp)稀释1000倍，100ul/孔；37℃孵育30min；孵育完毕后，pbs-t洗板5次；显色a液：显色b液＝1:1，现配现用；每孔100ul，37℃孵育15min；加入终止液，50ul/孔，终止显色反应，检测吸光度，结果如表2所示：抗体6a5、3f6、5g1灵敏度均高于购买的商品化单抗。
[0097]
表2 taq dna聚合酶单克隆抗体灵敏度检测结果
[0098][0099]
实施例3 taq dna聚合酶单克隆抗体特异性检测
[0100]
1)elisa法检测单抗特异性：采用elisa法检测taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)是否非特异结合pcr体系中的其他蛋白(如反转录酶)，以此检测抗体特异性。抗原(taq dna聚合酶(抗逆酶)，反转录酶，反转录酶购于promega，货号m170a)用碳酸盐包被液稀释后包被96孔板，100ng/孔，37℃热孵2h，孵育完毕后pbs-t洗板1次；加入上述taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)单克隆抗体(稀释至浓度为1mg/ml，用样本稀释液按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800)，37℃孵育30min；孵育完毕后，pbs-t洗板5次；酶标稀释液将hrp标记抗体(羊抗鼠igg-hrp)稀释1000倍，100ul/孔；37℃孵育30min；孵育完毕后，pbs-t洗板5次；显色a液：显色b液＝1:1，现配现用；每孔100ul，37℃孵育15min；加入终止液，50ul/孔，终止显色反应，检测吸光度，结果如表3所示：taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)不与反转录酶发生非特异性反应，只特异性结合taq dna聚合酶。
[0101]
表3 taq dna聚合酶抗体特异性检测结果
[0102][0103]
2)western blot检测单抗特异性：抗原(taq dna聚合酶(抗逆酶)，反转录酶，终浓度分别为0.3、0.5mg/ml)按体积比3：1加入上样缓冲液，煮沸5min后各点样4孔，10ul/孔，进行12％sds-page电泳；经半干转法将sds-page胶上的抗原蛋白转至nc膜，放入含有5％脱脂奶粉的tbs-t封闭30min；取出nc膜分别按8孔道剪开，将3种taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)分别1:1000稀释后孵育上述nc膜条，同时置于37℃孵育2h，tbs-t洗涤3次，10min/次，各加入二抗羊抗鼠igg-hrp，37℃孵育1h，tbs-t洗涤3次，加入显影液，置于凝胶成像仪中拍照，结果如图5所示：有条带说明有抗原与抗体特异性结合，没有条带说明没结合，即taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)能与taq dna聚合酶特异性结合，而不与反转录酶发生非特异性结合反应。
[0104]
实施例4 taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1)分别与taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶(抗逆抗体酶)及不含所述单克隆抗体的taq dna聚合酶(抗逆酶)对唾液样本的扩增效果对比
[0105]
实验组热启动酶的配制：taq dna聚合酶(抗逆酶)与taq dna聚合酶单克隆抗体(6a5、3f6、5g1，浓度均稀释至1mg/ml使用)按质量比为1:2时封闭效果最好，且无需室温静置，因此酶和抗体按质量比为1:2混匀后即可使用。按上述比例配制热启动酶，对唾液样本的pcr检测效果进行比较，反应体系如表4所示(对照组为不含taq dna聚合酶单克隆抗体的taq dna聚合酶(抗逆酶)，加入与所述实验组单克隆抗体等体积的酶稀释液(即20mm tris-hcl(ph8.0)缓冲液)，实验组和对照组的酶使用浓度均为0.2mg/ml)，mix-n为fam-ccatggggccaaggaggtgtcac(seq id no.11)-bhq；mix-g22813t f2为5
’‑
agcgaggactgcagcgtaga-3’(seq id no.12)；mix-g23012a f2-2为5
’‑
atgcctg attagtggattgg-3’(seq id no.13)；反应程序如表5所示，结果如图6所示：从扩增曲线来看热启动酶(taq dna聚合酶(抗逆酶)+taq dna聚合酶单克隆抗体)的荧光值或ct值均优于对照组(taq dna聚合酶(抗逆酶))，说明taq dna聚合酶单克隆抗体有利于提高taq dna聚合酶(抗逆酶)的灵敏度及扩增效率；其中单克隆抗体6a5制备的抗逆抗体酶表现最为突出，后续选taq dna聚合酶单克隆抗体6a5进一步测试。
[0106]
表4荧光定量pcr反应体系
[0107]
试剂名称来源批号1test用量/ul10x pcr buffer2promegam190cs2
25mm mgcl2promegaa351as22.5mm dntps生工d00560.15mix-n擎科202102260.5mix-g22813t f2擎科202103010.36mix-g23012a f2-2擎科202102260.56含20％唾液的样本/202102205所述热启动酶或抗逆酶自制202007030.1pcr级用水生产部20201215补至20
[0108]
表5荧光定量pcr反应程序
[0109][0110]
实施例5 taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶制备的热启动酶(抗逆抗体酶)与市售含抗体的热启动酶对唾液样本的扩增效果比较
[0111]
taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)而成的热启动酶的配制过程同实施例4，taq dna聚合酶(抗逆酶)与所述taq dna聚合酶单克隆抗体6a5(浓度稀释至1mg/ml使用)按质量比为1:2配制，酶使用浓度0.2mg/ml；市售含抗体的热启动酶(exhot start version，普通抗体酶)购自takara。分别采用上述热启动酶，对含唾液的样本进行荧光定量pcr检测，反应体系如表4所示，反应程序如表5所示，结果如图7所示：taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶配制的热启动酶的检测效果优于市售抗体的热启动酶(exhot start version)：荧光值较高、ct值较小，即抗逆抗体酶(热启动酶)的扩增效率和灵敏度优于市售抗体酶。
[0112]
实施例6 taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶制备的热启动酶(抗逆抗体酶)与传统抗体+taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶对唾液样本的扩增效果对比
[0113]
实验组taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)而成的热启动酶的配制过程同实施例4，对照组普通taq dna聚合酶抗体(购自takara，货号9002a)与taq dna聚合酶(抗逆酶)按使用说明书配制，实验组和对照组的抗逆酶最后使用浓度均为0.2mg/ml。分别采用上述热启动酶，对唾液样本的pcr检测效果进行比较，反应体系如表4所示，反应程序如表5所示，结果如图8所示：taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taqdna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶的检测效果优于普通taq dna聚合酶抗体(购自takara)与taq dna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶：荧光值较高、ct值较小，表明taq dna聚合酶单克隆抗体6a5配制的热启动酶的扩增效率和灵敏度优于普通taq dna聚合酶抗体(购自takara)。
[0114]
实施例7 taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶的稳定性测试
[0115]
taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)而成的热启动酶的配制过程同实施例4；将热启动酶于-80℃～0℃之间反复冻融5、20、30次后通过荧光定量pcr检测其扩增效率，反应体系和反应程序如表4、5所示，结果如图9所示：-80℃～0℃之间反复冻
融30次不影响热启动酶的活性。
[0116]
将上述热启动酶于4℃、室温(25℃)、37℃分别放置4h、24h、7d后通过荧光定量pcr检测其扩增效率，荧光定量pcr反应体系和反应程序分别如表4、5所示，测试结果如图10所示：结果显示4℃、室温、37℃分别放置4h、24h、7d后不影响热启动酶的活性，即本发明提供的热启动酶具有极高的稳定性，对试剂稳定性和有效性以及在使用和运输等过程中短期偏离正常保存条件具有重要意义。
[0117]
实施例8 taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)制备的热启动酶的特异性和灵敏度测试
[0118]
1)特异性检测：考虑到热启动酶用于一步法rt-pcr体系，选择特异性实验测试温度为37℃和55℃。taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)而成的热启动酶的配制过程同实施例4，采用taq dna聚合酶单克隆抗体6a5+taq dna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶(实验组taq dna聚合酶(抗逆酶)与上述taq dna聚合酶单克隆抗体6a5(浓度稀释至1mg/ml使用)按质量比为1:2配制，酶使用浓度0.2mg/ml)和不含taq dna聚合酶单克隆抗体的taq dna聚合酶(抗逆酶)(对照组，加入与上述实验组单克隆抗体等体积的酶稀释液，实验组和对照组的酶使用浓度均为0.2mg/ml)进行对比，反应体系同表4；每隔3min收集荧光，结果如图11所示：taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dn a聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶在两种温度条件下均不反应产生荧光信号，表明taq dna聚合酶活性被taq dna聚合酶单克隆抗体较好的封闭，而对照taq dna聚合酶(抗逆酶)因不含聚合酶抗体导致taq dna聚合酶活性没有被阻断而出现不同程度地聚合反应，表现为荧光信号随时间延长而增加。
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2)灵敏度检测：参考表6和表5的荧光定量pcr反应体系和反应条件对热启动酶进行灵敏度检测，其中，adv-f:5
’‑
acttcgtttattctggatct-3’(seq id no.22)；adv-r:5
’‑
tttttttgggtaacactttt-3’(seq id no.23)；mix-m:fam-tatcaacacaacaactctgg(seq id no.24)-bhq；采用taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶进行反应，1.46x103拷贝数的adv病毒样本(adv病毒的核酸提取物)为模板(加入量为5ul)，将该样本分别稀释100倍(10-2
)和1000倍(10-3
)后进行荧光定量pcr检测(重复2次)，稀释100倍的模板扩增后的ct分别为30.23、30.14，稀释1000倍的模板扩增后的ct分别为33.36、33.18；电泳图如图12所示，pcr产物送生工生物测序结果显示稀释100倍的模板的pcr产物测序序列经blast比对与模板完全匹配，表明taq dna聚合酶单克隆抗体6a5与taq dna聚合酶(抗逆酶)配制的热启动酶比专利文献cn113321733a的抗体酶的检测灵敏度还高2个数量级，具有更高的灵敏度(约1.5拷贝)。
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表6荧光定量pcr反应体系
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试剂名称来源批号1test用量/ul10x pcr buffer2promegam190cs225mm mgcl2promegaa351as22.5mm dntps生工d00560.15mix-m擎科202103090.5mix-adv-f擎科202103100.36mix-adv-r擎科202103100.56
adv样本/202102205所述热启动酶或抗逆酶自制202007030.1pcr级用水生产部20201215补至20
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实施例9taq dna聚合酶单克隆抗体6a5抗体轻链基因和重链基因的提取与序列分析
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1)杂交瘤细胞rna提取及cdna合成：收集新鲜的15ml生长至对数期的分泌taq dna聚合酶单克隆抗体6a5的杂交瘤细胞f10-6a5，经无血清培养基洗涤后，用trizol法提取细胞总rna；再以总rna为模板，以oligo dt和random primer(购自takara，货号分别为3805和3801)为引物，经m-mlv逆转录酶形成cdna。
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2)单链抗体重链和轻链可变区基因的扩增：反应条件为94℃，预变性5min，94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃10min；以上述cdna为模板，分别以本实验室保存的鼠源抗体可变区重、轻链引物混合物(重链引物包括：vh1f:ggtggttcctctagatcttccctcgaggtrmagcttcaggagtc(seq id no.14)，vh2f:ggtggttcctctagatcttccctcgaggtbcagctbcagcagtc(seq id no.15)，vh3f:ggtggttcctctagatcttccctcgaggtgcagctgaagsastc(seq id no.16)，vh-r1:cctggccggcctggccactagtgacagatggggstgtygttttggc(seq id no.17)；轻链引物包括：vk-1f:gggcccaggcggccgagctcgayatccagctgactcagcc(seq id no.18)；vk-2f:gggcccaggcggccgagctcgayattgttctcwcccagtc(seq id no.19)；vk-3f:gggcccaggcggccgagctcgayattgtgmtmactcagtc(seq id no.20)；vk-r1:ggaagatctagaggaaccaccgcccgagccaccgccaccagaggatttkatttccagyttggtccc(seq id no.21))为引物扩增得到单克隆抗体可变区的重链和轻链基因pcr产物。将上述pcr产物回收连接至t载体，所得重组质粒送擎科生物科技有限公司测序，测序得到轻链可变区基因序列为gatattcagatgattcagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgttcggaggggggaccaagctggagc(seq id no.3)和重链可变区基因序列为gaggtgcacctggtggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcactgtctcagggttctcattaaccgactatggtgtaacctggattcgccagcctccaggaaggggtctggagtggctgggagtaatatggggtggtggaagcacattctataattcaactctcaaatccagactgagcgtcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttgagaatgaacagtctgcaatctgatgacacagccatgtactactgtgccaaactagaactgggacgagggtactttgactactggggccagggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacgaca(seq id no.4)；轻链可变区氨基酸序列为diqmiqspaslavslgqratisyrasksvstsgysymhwnqqkpgqpprlliylvsnlesgvparfsgsgsgtdftlnihpveeedaatyycqhireltrseggpsws(seq id no.1，其中下划线部分依次为cdr1、cdr2、cdr3)和重链可变区氨基酸序列为evhlvesgpglvapsqslsitctvsgfsltdygvtwirqppgrglewlgviwgggstfynstlksrlsvskdnsksqvflrmnslqsddtamyycaklelgrgyfdywgqgttltvssaktt(seq id no.2，其中下划线部分依次为cdr1、cdr2、cdr3)。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。