一种检测猕猴桃性别的方法

1.本发明涉及猕猴桃的分子遗传育种技术领域，更具体地，涉及一种检测猕猴桃性别的方法。


背景技术：

2.猕猴桃作为“水果之王”，其营养丰富，附加值高，备受消费者喜爱。目前，生产上栽培的猕猴桃种类主要为中华猕猴桃和美味猕猴桃，其次是毛花猕猴桃和软枣猕猴桃。猕猴桃为功能性雌雄异株植物，雌株的经济价值明显高于雄株，雄株在生产上多作为授粉配对用树而少量配置。猕猴桃属植物在实生育种过程中童期较长，雌雄株早期在形态上差异较小，常规手段不能识别，直到猕猴桃幼苗种植数年开花后才能鉴别植株的性别。大量不结果雄株的种植不仅浪费大量的人力物力，也延长了育种周期。中华猕猴桃是生产中栽培的主要猕猴桃种类之一，因此，开发中华猕猴桃早期性别鉴定的分子标记已经成为亟需解决的问题。
3.近年来，国内外研究者相继开发出猕猴桃属植物性别鉴定的分子标记。gill等通过集团分离分析法(bulk segregant analysis，bsa)开发出雄性特异性标记smy1，其对中华猕猴桃性别的鉴定准确率为88％。张琼等利用rad-seq技术开发的ssr(simple sequence repeats)标记能有效鉴定该研究中所用的山梨和中华猕猴桃杂交群体174个f1代个体的性别，但在其他种内通用性较差。朱立武等研发的申请号为201911407340.5的相关分子标记能用于中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃、大籽猕猴桃等八个种的雌雄株进行准确鉴定。张琼等研发的申请号为202010136148.3的相关分子标记适用于中华猕猴桃、美味猕猴桃、大籽猕猴桃、软枣猕猴桃、山梨猕猴桃、毛花猕猴桃和黑蕊猕猴桃的性别鉴定。但上述两种通用性较强的分子标记均未在育种实践中通过大量的群体验证其准确性。因此，开发通用性好、操作简单快速、鉴定准确率高的针对中华猕猴桃实生苗性别早期鉴定的分子标记对于中华猕猴桃育种而言具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种检测猕猴桃性别的方法，解决了现有技术中中华猕猴桃雌雄株早期在形态上差异较小，常规手段不能识别的问题。
5.本发明的第一个目的是提供一种检测猕猴桃性别相关的分子标记的试剂。
6.本发明的第二个目的是提供所述试剂在检测猕猴桃性别或制备检测猕猴桃性别的试剂盒中的应用。
7.本发明的第三个目的是提供一种检测猕猴桃性别的方法。
8.本发明的第四个目的是提供一个检测猕猴桃性别的试剂盒。
9.本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
10.本发明要求保护一种检测猕猴桃性别相关的分子标记的试剂，所示分子标记的核苷酸序列如seq id no:3所示，雄性猕猴桃含有所述分子标记，雌性猕猴桃不含有所述分子
标记。
11.优选地，所述试剂为核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物。
12.本发明还要求保护所述试剂在检测猕猴桃性别或制备检测猕猴桃性别的试剂盒中的应用。
13.优选地，所述试剂为核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物。
14.在本发明的一个实施例中提供了一种检测猕猴桃性别的方法，检测核苷酸序列如seq id no:3所示的分子标记，雄性猕猴桃含有所述分子标记，雌性猕猴桃不含有所述分子标记。
15.优选地，所述试剂为核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物。
16.更优选地，包括以下步骤：
17.s1、取样：
18.取中华猕猴桃dna，作为模板dna；
19.s2、pcr扩增
20.pcr体系：模板dna 1μl、核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物各1μl、1.1
×
t3super pcr mix 37μl，
21.pcr程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，66℃延伸15s，35个循环；66℃延伸10min；4℃保存；
22.s3、电泳
23.pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
24.优选地，取100mg左右中华猕猴桃幼嫩叶片，经液氮研磨后用植物基因组提取试剂盒提取dna。
25.在本发明的另一个实施例中提供了一个检测猕猴桃性别的试剂盒，含有所述的试剂。
26.优选地，所述试剂为核苷酸序列如seq id no:1～2所示的引物。
27.更优选地，还含.1
×
t3 super pcr mix。
28.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29.中华猕猴桃雌雄株早期在形态上差异较小，常规手段不能识别，因此如能对幼苗性别进行早期鉴定，则能大量节约育种时间和成本。本发明提供了一种可用于中华猕猴桃实生苗早期性别鉴定的分子标记，并在此基础上建立了一种中华猕猴桃性别辅助选育试剂盒和一种中华猕猴桃性别早期快速鉴定方法，通过在已知性别186份中华猕猴桃单株中进行检测，测试准确率可达100％，且本发明分子标记和方法通用性好、操作简单快速、鉴定准确率高，具有很大的应用前景。
附图说明
30.图1为产物片段为148bp的引物扩增结果(f1～f75和m97～m111)。
31.图2为产物片段为148bp的引物扩增结果(m1～m96)。
32.图3为实施例3的分子标记的引物对186个猕猴桃的雌雄鉴定示意图；dl2000marker从上往下条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。左图f1-f75依次为1-75号雌性样品，m97-m111为雄性样品97到111号，右图m1-m96依次为1-96
号雄性样品。
33.图4为对比例1的分子标记的引物对猕猴桃的雌雄鉴定示意图。m为dl2000marker。f1、f2和f3为3个中华猕猴桃雌性样品，m1、m2和m3为3个中华猕猴桃雄性样品。a001、a002和a003为3对不同的引物。
34.图5为对比例2的分子标记的引物对猕猴桃的雌雄鉴定示意图。dl2000 marker从上往下条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。上图f1-f75依次为1-75号雌性样品，m97-m111为雄性样品97到111号，下图m1-m96依次为1-96号雄性样品。
具体实施方式
35.下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
36.实施例1用于中华猕猴桃性别鉴定的分子标记引物的获得
37.一、实验方法
38.对中华猕猴桃雌、雄样本进行基因组测序，通过序列比对并结合相关数据库中关于猕猴桃基因注释结果，在猕猴桃雌、雄样本差异区段设计4对特异性引物：
39.第一对特异性引物：
40.上游引物f：ttgatttgtattgctctggtgct(seq id no:1)；
41.下游引物r：agaggccactttagcattctattag(seq id no:2)。
42.第二对特异性引物：
43.上游引物f：ccttttccagttggtagaacgtat
44.下游引物r：ctgcttctccgaatcttggtc
45.第三对特异性引物：
46.上游引物f：gatcggaccaattagttcaacca
47.下游引物r：gttctaccaactggaaaagggag
48.第四对特异性引物：
49.上游引物f：ttggctaggccaatggaatat
50.下游引物r：tcagtctacaccaagtaagagcaac
51.2、pcr扩增
52.pcr反应体系:模板dna 1μl、上游引物f和下游引物r各1μl、1.1
×
t3 super pcr mix 37μl。
53.pcr程序：98℃预变性3min，98℃变性10s，58℃退火10s，66℃延伸15s(后三个步骤35个循环)，66℃延伸10min，4℃保存。
54.二、实验结果
55.四对引物分别对猕猴桃个体扩增，理论上，雄性样本扩增得到特异条带，雌性样品没有条带。四对引物的理论扩增产物如下：
56.第一对特异性引物的理论扩增产物，329bp(seq id no:3：)：ttgatttgtattgctctggtgcttctttccatttggtcctcatggatatggaaatgcctgtcatggatggtcccaaggttagctccctcttcattcttttcattttttcaaaaaaaaatgtctaaaatatttatttgttattttttttatagataaacatatagcaaca
tacatatatatctacaatattgttaaaatatggaacatcttagagcatcttcagtggactcactaaagaacttttttttgtttactcatttgactacacatgttcaattaacatatttttgtcatttttttgcctctaatagaatgctaaagtggcctct。
57.第二对特异性引物的理论扩增产物159bp：
58.ccttttccagttggtagaacgtatgattttaaaatatttccctagggcttagcctaattatatttagttttttcgcaggcaaccagggagctaagaggcatggaagtgagcagcatgattgtagggatgacttcgcgggaccaagattcggagaagcag
59.第三对特异性引物的理论扩增产物，170bp：
60.gatcggaccaattagttcaaccaaatgaaccgtcgatcggtccgactttcagtcctgtctattagaattattaatgatataattataacataatggtttaattattccagttttatacgaagtttgaatcggtgattcgtccaccaactcccttttccagttggtagaac
61.第四对特异性引物的理论扩增产物148bp：
62.ttggctaggccaatggaatatccaatgactttataaattatacaatatttagcacacaaaattagaattctttttgcttatatgtacacttcaacacatattttttttgtctagtgtattaaagttgctcttacttggtgtagactga
63.其中，第一对特异性引物的扩增产物329bp与理论产物一致，并且雄性样本扩增得到特异条带，雌性样品没有条带；其他3对引物扩增片段长度分别为159bp、170bp和148bp，片段较短，易与引物二聚体混淆。
64.但是，这3对引物的扩增效率相对较低。其中，产物片段为148bp的引物扩增结果如下图所示，部分片段不是很清晰。dl2000 marker从上往下条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp。图1中f1～f75依次为1～75号雌性样品，m97～m111为雄性样品97到111号，图2中m1～m96依次为1～96号雄性样品。
65.实施例2一种中华猕猴桃性别的鉴定的方法
66.1、取样
67.取100mg左右中华猕猴桃幼嫩叶片，经液氮研磨后用植物基因组提取试剂盒提取dna，用ddh2o将dna稀释至20ng/μl作为pcr模板。
68.2、pcr扩增
69.pcr体系：模板dna 1μl、核苷酸序列如seq id no:1～2所示的上游引物f和下游引物r各1μl、1.1
×
t3 super pcr mix 37μl。
70.pcr程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，66℃延伸15s，35个循环；66℃延伸10min；4℃保存。
71.3、电泳
72.pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
73.4、结果判读
74.雄性样本可以扩增得到329bp的特异条带，雌性样品没有条带。
75.实施例3中华猕猴桃性别的鉴定
76.一、实验方法
77.1、样本
78.浙江地区6个地市县取75份雌性和111份雄性中华猕猴桃资源的幼嫩叶片，置于液
氮冷冻之后，保存于-80℃冰箱。
79.2、取样
80.用植物基因组提取试剂盒提取dna，用ddh2o将dna稀释至20ng/μl作为pcr模板。
81.3、pcr扩增
82.pcr体系：模板dna 1μl、核苷酸序列如seq id no:1～2所示的上游引物f和下游引物r各1μl、1.1
×
t3 super pcr mix 37μl。
83.pcr程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，66℃延伸15s，35个循环；66℃延伸10min；4℃保存。
84.4、电泳
85.pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
86.同实施例2。
87.二、实验结果
88.结果如图3所示，所有的雄性样本可以都得到329bp的特异条带，雌性样品都没有条带。鉴定的准确率100％。
89.实施例4一种中华猕猴桃性别鉴定试剂盒
90.一、组成
91.核苷酸序列如seq id no:1～2所示的上游引物f和下游引物r、1.1
×
t3 super pcr mix。
92.二、使用方法
93.1、取样
94.采集猕猴桃样本幼嫩叶片，置于液氮冷冻之后，保存于-80℃冰箱。
95.取100mg左右中华猕猴桃幼嫩叶片，经液氮研磨后用植物基因组提取试剂盒提取dna，用ddh2o将dna稀释至20ng/μl作为pcr模板。。
96.2、pcr扩增
97.pcr体系：模板dna 1μl、上游引物f和下游引物r各1μl、1.1
×
t3 super pcr mix 37μl。
98.pcr程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火10s，66℃延伸15s，35个循环；66℃延伸10min；4℃保存。
99.3、电泳
100.pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
101.三、结果判读
102.雄性样本可以扩增得到329bp的特异条带，雌性样品没有条带。
103.对比例1
104.一、实验方法
105.1、样本
106.用3个雌性(f1-f3)和3个雄性(m1-m3)中华猕猴桃资源的幼嫩叶片，置于液氮冷冻之后，保存于-80℃冰箱。
107.2、取样
108.用植物基因组提取试剂盒提取dna，用ddh2o将dna稀释至20ng/μl作为pcr模板。
109.3、pcr扩增
110.10μl反应体系，包括：f和r引物各0.2μm、0.2mm dntps、2mm mgcl2、1μl 10x taq buffer、0.5units taq聚合酶、和50ng dna模板。
111.各组扩增引物见表1：
112.表1：
[0113][0114][0115]
pcr扩增程序为：
[0116]
95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火35s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸5～10min。
[0117]
4、电泳
[0118]
pcr扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(8％)。
[0119]
二、实验结果
[0120]
如图4所示，以上述3对引物(来自于zhang q,liu cy,liu yf,et al.high-density interspecific genetic maps of kiwifruit and the identification of sex-specific markers.dna research,2015,22(5):367-375.)进行检测，所得产物中均未发现性别特异条带。
[0121]
对比例2
[0122]
一、实验方法
[0123]
1、样本
[0124]
用已知性别的10个中华猕猴样本的幼嫩叶片，置于液氮冷冻之后，保存于-80℃冰箱。
[0125]
2、取样
[0126]
用植物基因组提取试剂盒提取dna，用ddh2o将dna稀释至20ng/μl作为pcr模板。
[0127]
3、pcr扩增
[0128]
以通用分子标记引物进行pcr扩增。
[0129]
通用分子标记引物：
[0130]
f：cgacacaatgcaactcctgc；
[0131]
r：tggtcgaggttaatcaaatag。
[0132]
4、电泳
[0133]
pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0134]
二、实验结果
[0135]
通用分子标记引物来自于中国专利申请cn202010136148.3，理论上female无扩增产物，male：扩增产物442bp，但是发明人反复调整退火温度等pcr条件均没有扩增出目的条
带。
[0136]
对比例3
[0137]
一、实验方法
[0138]
1、样本
[0139]
用已知性别的186个已知性别的中华猕猴桃样品的幼嫩叶片，置于液氮冷冻之后，保存于-80℃冰箱。
[0140]
2、取样
[0141]
用植物基因组提取试剂盒提取dna，用ddh2o将dna稀释至20ng/μl作为pcr模板。
[0142]
3、pcr扩增
[0143]
pcr体系：模板dna 1μl、引物2μl(smy1引物，上下游引物各1μl)、1.1
×
t3 super pcr mix 37μl。
[0144]
smy1引物：
[0145]
f：tcgcaattcgttagggatgatgcg；
[0146]
r：cataatcaaccatccataaaaaccat。
[0147]
pcr程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，58-54℃touchdown退火11s，66℃延伸15s，35个循环；66℃延伸10min；4℃保存。
[0148]
female无扩增产物，male：扩增产物770bp，
[0149]
二、实验结果
[0150]
结果如图5所示，雌性样品全部没有条带，雄性样品检出率90.9％(图5)，二次检出率为95.49％。smy1引物来自于gill gp,harvey cf,gardner rc,et al.development of sex-linked pcr markers for gender identification in actinidia.theoretical&applied genetics,1998,97(3):439-445.检测时杂带较多，易与目的条带混淆，影响检测效率。
[0151]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。