idno.4、seqidno.5、seqidno.6，及seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6的任意组合。12.本发明的另一目的为提供一种医药组成物，包含一如前所述的抗-t细胞奈米抗体及一医药学上可接受的载剂。13.本发明的另一目的为提供一种如前所述的抗-t细胞奈米抗体用于制备一治疗癌症、免疫调节及活化免疫细胞的医药品的用途。14.本发明的另一目的为提供一种用于检测cd3ε表现量的方法，包含对一待测样品投予一如前所述的抗-t细胞奈米抗体。15.在本发明的一实施例中，该待测样品是血液、尿液、痰液、唾液、体液、肿瘤、器官、组织或细胞。16.综上所述，本发明抗-t细胞奈米抗体的功效在于：藉由t细胞(即周边血液单核细胞)增殖及活化分析(tcell(i.e.,peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)proliferationandactivationassay)证明抗-cd3ε奈米抗体可促进t细胞群聚增生及活化、增强pbmc中cd3阳性t细胞增殖、增强γδt(gdt)细胞中cd3阳性t细胞增殖、藉由西方墨点分析(westernblotting)证明抗-cd3ε奈米抗体可以识别人类t细胞的细胞溶解产物中的cd3ε蛋白质、藉由免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining,ihcstaining)及流动式细胞测量分析(flowcytometricanalysis)证明抗-cd3ε奈米抗体可藉由流动式细胞测量分析侦测细胞样品中cd3ε的表现、藉由表面电浆子共振结合分析(surfaceplasmonresonancebindingassay,sprbindingassay)证明抗-cd3ε奈米抗体以0.5056nm内的kd有效结合cd3ε/cd3δ异二聚体，及藉由免疫细胞化学分析证明抗-cd3ε奈米抗体可用来侦测细胞样品中cd3ε的表现，藉此可达到治疗癌症、免疫调节及活化免疫细胞的效用。特别地，本发明抗-t细胞奈米抗体可扮演调节免疫功能及活化免疫细胞的角色，且相较于习知的抗体必须藉由载体将基因转染至细胞中表现抗体功能而有低产量及效果不彰的缺点，本发明抗-t细胞奈米抗体可在体外大规模制备后直接投药至需要的个体内进行治疗。另外，本发明也可达到检测cd3ε表现量的效用。17.以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。18.【图式简单说明】19.图1a及图1b显示抗-cd3ε奈米抗体的t细胞(即周边血液单核细胞)增殖及活化分析(tcell(i.e.,peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)proliferationandactivationassay)结果。20.图2a至图2c显示抗-cd3ε奈米抗体在增强pbmc中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估的结果，其中cd3enb表示抗-cd3ε奈米抗体，vehicle表示载体。21.图3a至图3d显示抗-cd3ε奈米抗体在增强gammadeltat(gdt)细胞中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估的结果，其中cd3enb表示抗-cd3ε奈米抗体，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。22.图4显示抗-cd3ε奈米抗体的西方墨点分析(westernblotting)结果，其中上排数字表示t细胞蛋白质溶解产物(proteinlysate)的量(μg)，(a)使用传统抗体#ab135372，其nanobody”、“抗-cd3ε奈米抗体”及“抗-t细胞奈米抗体”可交换使用。33.如本文中所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指缓解(alleviating)、减少(reducing)、改善(ameliorating)、减轻(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障碍(disorder)的一或多个临床征兆(clinicalsign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆转(reversing)一正在被治疗中的病况(condition)或症状(symptom)的严重性(severity)的进展(progression)。34.依据本发明的医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠道地(parenterally)投药的剂型(dosageform)，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似之物。[0035]依据本发明的医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：腹膜内注射(intraperitonealinjection)、皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)、肌肉内注射(intramuscularinjection)、静脉内注射(intravenousinjection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。[0036]依据本发明的医药品可包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药学上可接受的载剂。例如，该医药学上可接受的载剂可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术之人士的专业素养与例行技术范畴内。[0037]依据本发明的该医药学上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)，以及它们的组合。[0038]如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核酸片段”等术语意指呈单股或双股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且当中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturallyoccurringnucleotides)或人造化学仿效物。如本文中所用的，“核酸”此术语可与“基因”、“cdna”、“mrna”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交换使用。[0039]实施例1.抗-cd3ε奈米抗体的制备[0040]在本实施例中，抗-cd3ε(cd3epsilon)奈米抗体(nanobody,nb)的制备流程如下。关于重链可变域(heavychainvariabledomain,vhh)的生产流程如下。vhh基因建构于表现载体pet22b(amp抗性)或psb-init(cmr抗性)中；质体经限制性内切酶消化及定序验证鉴定。将1μl经鉴定的质体(约50ng)加入bl21(de3)中，37℃作用过夜。用单菌落接种含有抗性的lb培养基，并在37℃、220r/min下培育培养物过夜。隔夜培养物以1:100的比例接种于含抗性的新鲜lb培养基(10l-20l)中，并于37℃、220r/min培养。当od600达至0.8时，冷却至室温。加入最终浓度为0.1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside,iptg)，20℃、220r/min诱导过夜。藉由离心(20mmtrisph8.0、150mmnacl)在细胞破裂后获取细胞及上清液。上清液藉由流通(flow-through)与ni-nta珠粒(1ml)结合。用含有合适梯度咪唑(imidazole)(10mm、20mm、50mm、100mm、250mm及500mm)的缓冲液清洗并洗脱ni-nta珠粒。用sds-page分析洗脱部分，根据蛋白质的纯度及产量(离子交换层析或凝胶过滤层析)确定后续的纯化方案。符合要求的蛋白质藉由凝胶过滤层析分离纯化，缓冲液更换为pbs缓冲液。用sds-page分析蛋白质组分，将符合要求的组分合并浓缩，用0.22μm滤膜过滤、分装。之后，将蛋白质储存于-20℃或更低温度。[0041]关于奈米抗体是生产及纯化自大肠杆菌(e.coli)。为了生产奈米抗体形式的大肠杆菌，参考文献microbcellfact.2019mar11；18(1):47来进行。简言之，使用大肠杆菌菌株hb2151。编码胺苄青霉素(ampicillin)抗性的质体pet(creativebiolab)被用于细胞质蛋白生产。用cd3ε或cd3ε多专一性奈米抗体质体新转化的大肠杆菌hb2151被接种在5ml含有50μg/ml胺苄青霉素的培养基中，并在37℃培养过夜。之后，将1ml这种预培养物接种到100ml培养基中并在37℃下生长。过夜培养后，每100ml培养物中加入两片enpresso加强片及额外剂量的葡萄糖释放酶(0.6u/l)。同时，藉由加入1mmiptg持续24小时诱导重组奈米抗体蛋白质表现。然后收集培养物并在冰上冷却5分钟，然后在6,000×g及4℃下离心15分钟。去除上清液后，细胞沉淀物藉由高容量myc-tag结合树脂使用固定化金属亲和层析(immobilizedmetalaffinitychromatography,imac)进行纯化。根据制造商操作流程(clontechlaboratories)在天然条件下进行基于重力流的层析(gravity-flow-basedchromatography)。藉由向每个200mg细菌细胞沉淀物添加1mlxtractor细胞裂解缓冲液(clontechlaboratories)，并辅以不含edta的蛋白酶抑制剂混合物(rochediagnostics)及25u核酸内切酶(thermoscientificpierce)，可实现有效的细胞裂解。在冰上作用15分钟、10,000×g及4℃离心20分钟以去除细胞碎片后，将澄清的上清液加到含有1ml预装树脂的重力流管柱上，并在室温下作用30分钟。在藉由添加含有300mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱奈米抗体之前，用20及40mm的咪唑浓度清洗管柱两次。使用截留分子量为3.5-5kda的纤维素酯膜(celluloseestermembrane)(laboratories)藉由对pbs进行透析来去除咪唑及更换缓冲液。[0042]cd3εvhh由人类单域抗体库(humansingledomainantibodylibrary)(creativebiolabs)生成。简而言之，在用cd3ε抗原结合/洗涤/洗脱进行四轮汰洗(panning)后，挑取约100个选殖株，然后藉由噬菌体酵素结合免疫吸附分析法(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)选择阳性单株噬菌体。对阳性选殖株进行桑格法(sangermethod)定序，得到奈米抗体序列。[0043]关于进行dna定序的选殖株项目显示于下表1。[0044]表1h07e)。5或7天后，记录总细胞数，然后用fitc-缀合的cd3单株抗体(okt3,11-0037-42,ebioscience)染色，然后藉由流动式细胞测量术进行分析。照片是用显微镜在40x下拍摄。cd3阳性细胞数计算为cd3细胞百分比(％)×总细胞数。[0051]抗-cd3ε奈米抗体的t细胞(即周边血液单核细胞)增殖及活化分析结果显示于图1a及图1b。由图1a及图1b可见，本发明抗-cd3ε奈米抗体可促进t细胞群聚增生及活化。[0052]实施例3.抗-cd3ε奈米抗体在增强pbmc中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估[0053]在本实施例中，抗-cd3ε奈米抗体在增强pbmc中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估的操作流程如下。将1×106的pbmc细胞接种在12孔盘中，存在或不存在抗-cd3ε奈米抗体(10、100、1000、5000ng/ml)。接着，添加50iu/ml的il-2(gibco,phc0021)及2μg/ml的il-15(sinobiological,catno:10360-h07e)。3或7天后，记录总细胞数，然后用fitc-缀合的cd3单株抗体(okt3,11-0037-42,ebioscience)染色，然后藉由流动式细胞测量术进行分析。照片是用显微镜在40x下拍摄。cd3阳性细胞数计算为cd3细胞百分比(％)×总细胞数。[0054]抗-cd3ε奈米抗体在增强pbmc中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估的结果显示于图2a至图2c，其中cd3enb表示抗-cd3ε奈米抗体，vehicle表示载体。由图2a至图2c可见，抗-cd3ε奈米抗体以丛集形成(clusterformation)的方式显著地刺激pbmcs中cd3阳性t细胞增殖。[0055]实施例4.抗-cd3ε奈米抗体在增强γδt(gdt)细胞中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估[0056]在本实施例中，抗-cd3ε奈米抗体在增强γδt(gdt)细胞中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估的操作流程如下。将1×106的初代γδt(gdt)细胞细胞接种在12孔盘中，存在或不存在抗-cd3ε奈米抗体(10、100、1000、5000ng/ml)。接着，添加50iu/ml的il-2(gibco,phc0021)及2μg/ml的il-15(sinobiological,catno:10360-h07e)。3或7天后，记录总细胞数，然后用fitc-缀合的cd3单株抗体(okt3,11-0037-42,ebioscience)染色，然后藉由流动式细胞测量术进行分析。照片是用显微镜在40x下拍摄。cd3阳性gdt细胞数计算为cd3gdt细胞百分比(％)×总细胞数。[0057]抗-cd3ε奈米抗体在增强gammadeltat(gdt)细胞中cd3阳性t细胞增殖上的效用评估的结果显示于图3a至图3d，其中cd3enb表示抗-cd3ε奈米抗体。本实施例的结果显示，抗-cd3ε奈米抗体可以剂量依赖方式有效地增强γδt细胞增殖。[0058]实施例5.抗-cd3ε奈米抗体的西方墨点分析(westernblotting)结果[0059]在本实施例中，抗-cd3ε奈米抗体的西方墨点分析(westernblotting)的操作流程如下。在含有蛋白酶抑制剂混合物的pro-prep蛋白质萃取溶液(intron，台北市，中国台湾省)中获取细胞，并在4℃下剧烈振荡15分钟，然后离心。收集上清液，然后使用bio-radbca试剂(bio-radhercules，ca，usa)测定蛋白质浓度。将30μg的每个样品裂解物在sds-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后电印迹到pvdf膜上。在tbst封阻中加入5％bsa后，将膜与初级抗体(溶于tbst中)在4℃下作用过夜。接着，清洗4次并以辣根过氧化酶(horseradishperoxidase,hrp)-缀合的山羊-抗小鼠或兔子igg(upstate,billerica,ma,usa)作用两小时。以tbst清洗4次后，印迹与supersignalwestpicoecl试剂(piercebiotechnology，rockford，il，usa)一起作用1分钟，然后藉由暴露于kodak-x-omat胶片来检测化学发光。[0060]抗-cd3ε奈米抗体的西方墨点分析结果显示于图4，其中上排数字表示t细胞蛋白performancetest)，在再生探索及表面性能测试之后，然后选择再生方法来运行实验。然后选择结合分析(bindinganalysis)及直接结合(directbinding)来研究蛋白质结合。选择动力学分析(kineticanalysis)并选择质量转移(masstransfer)进行结合实验的动力学分析。之后，进行数据分析及动力学常数确定。[0069]抗-cd3ε奈米抗体对cd3ε/cd3δ异二聚体的表面电浆子共振结合分析(sprbindingassay)结果显示于图7，其中分析浓度为62.5nm、31.25nm、15.625nm、7.8125nm、3.90625nm、1.953nm)，缔合时间(associationtime)为120秒，解离时间(dissociationtime)为600秒，kd:5.056×10-10＝0.5056nm，使用涂覆的cd3ε/cd3δ异二聚体重组蛋白质(acrobiosystems,cat:cdd-h52w1)，nta晶片。由图7可见，抗-cd3ε奈米抗体以0.5056nm内的kd有效结合cd3ε/cd3δ异二聚体。[0070]实施例9.抗-cd3ε奈米抗体的免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析结果[0071]在本实施例中，抗-cd3ε奈米抗体的免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析的操作流程如下。将细胞(1×105)接种在6孔盘的盖玻片上，培育过夜。在指定的处理后，将细胞固定在1％多聚甲醛(paraformaldehyde)中，用pbs清洗，在含有0.5％bsa的pbs中使用0.1％tritonx-100透化30分钟，用2％bsa封阻，并与专一性抗体(配于2％bsa/含有0.05％tween-20的pbs(pbst)中)一起作用。在清洗之后，将细胞与萤光素缀合的二级抗体一起作用，用pbst清洗，并使用含有抗褪色剂及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,dapi)的水性封固剂封固。在leicatcssp8x共焦显微镜(leica)下分析影像。[0072]抗-cd3ε奈米抗体的免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析结果显示于图8，其中抗-cd3ε奈米抗体的浓度为1ng/ml，sp7是传统抗-cd3抗体(1:500,ma1-90582,invitrogen)，二级抗体为抗-vhh-萤光素(fluorescein,fitc)(1:5000)。本实施例的结果显示，藉由免疫细胞化学分析，抗-cd3ε奈米抗体可用来侦测细胞样品中cd3ε的表现。[0073]综上所述，本发明抗-t细胞奈米抗体(即抗-cd3ε抗体)藉由t细胞(即周边血液单核细胞)增殖及活化分析(tcell(i.e.,peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)proliferationandactivationassay)证明抗-cd3ε奈米抗体可促进t细胞群聚增生及活化、增强pbmc中cd3阳性t细胞增殖、增强γδt(gdt)细胞中cd3阳性t细胞增殖、藉由西方墨点分析(westernblotting)证明抗-cd3ε奈米抗体可以识别人类t细胞的细胞溶解产物中的cd3ε蛋白质、藉由免疫组织化学染色(immunohistochemistrystaining,ihcstaining)及流动式细胞测量分析(flowcytometricanalysis)证明抗-cd3ε奈米抗体可藉由流动式细胞测量分析侦测细胞样品中cd3ε的表现、藉由表面电浆子共振结合分析(surfaceplasmonresonancebindingassay,sprbindingassay)证明抗-cd3ε奈米抗体以0.5056nm内的kd有效结合cd3ε/cd3δ异二聚体，及藉由免疫细胞化学分析证明抗-cd3ε奈米抗体可用来侦测细胞样品中cd3ε的表现，藉此可达到治疗癌症、免疫调节及活化免疫细胞的效用。特别地，本发明抗-t细胞奈米抗体可扮演调节免疫功能及活化免疫细胞的角色，且相较于习知的抗体必须藉由载体将基因转染至细胞中表现抗体功能而有低产量及效果不彰的缺点，本发明抗-t细胞奈米抗体可在体外大规模制备后直接投药至需要的个体内进行治疗。另外，本发明也可达到检测cd3ε表现量的效用。[0074]以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含权利要求书中。当前第1页12当前第1页12