大豆疫霉抗性鉴定的KASP分析标记及应用

本发明属于农业生物学，特别涉及大豆疫霉根腐病抗性鉴定的kasp分子标记及应用。

背景技术：

1、大豆起源于中国，又称黄豆，素有“田中之肉”、“绿色牛乳”之名，是主要的饲料和粮油作物，大豆的深加工产品深受人们的喜爱。大豆疫霉根腐病，又称大豆疫病，是由大豆疫霉菌(phytophthora sojae kaufmann&gerdemann)引起的严重危害大豆生产的毁灭性土传病害之一。大豆疫霉根腐病在我国黄淮海地区、长江流域等均有发生，可引起大豆根茎部腐烂、幼苗死亡，田间缺苗断垄，豆荚发育不良，空荚、瘪荚较多，种皮、胚和子叶均可带菌。

2、目前，防治大豆疫霉根腐病的方法，主要有：利用抗性大豆品种、喷施真菌杀菌剂、改良土壤排水状况、更改耕作栽培方式及使用含钙化合物等措施。其中，培育和种植抗性大豆品种是最有效、环保的防治措施。因此，筛选抗性资源、发掘新的抗病基因、阐明大豆疫霉根腐病抗性的遗传与分子机制十分必要。

3、传统的表型鉴定存在一定的局限性：耗时长，易受环境的影响，并且由于该菌的土传特性不能在大田中进行直接接种鉴定等缺点。鉴于目前大豆对大豆疫霉菌抗性表型鉴定的不足，开发新型的与疫霉根腐病抗性高通量筛选大豆抗性种质的分子标记，指导大豆的抗性育种具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于大豆疫霉根腐病抗性鉴定的kasp分子标记及应用，从而实现对大豆疫霉根腐病抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型，能够在大豆苗期筛选具有大豆疫霉根腐病抗性的植株，从而加速育种进程。

2、为实现上述目的，本发明提供与大豆疫霉根腐病抗性紧密相关的kasp分子标记引物对，所设计的kasp分子标记引物对包括连接第一荧光标签的上游引物seq id no.1、连接第二荧光标签的上游引物seq id no.2和通用下游引物seq id no.3。

3、本发明所述的第一荧光标签和第二荧光标签可以选择荧光pcr领域常用的荧光标签，确保二者不同即可，例如在一些实施例中，第一荧光标签为fam荧光标签，第二荧光标签为vic荧光标签；或者在另一些实施例中，第一荧光标签为vic荧光标签，第二荧光标签为fam荧光标签。

4、本发明还提供所述的kasp分子标记引物对在鉴定大豆疫霉根腐病抗性或易感性种质中的应用；仅检测到连接seq id no.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接seq id no.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。

5、本发明还提供所述的kasp分子标记引物对在大豆疫霉根腐病抗性或易感性早期鉴定和筛选的分子育种中的应用；仅检测到连接seq id no.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性品种；仅检测到连接seq id no.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性品种。

6、另一方面，本发明还提供了一种鉴定大豆疫霉根腐病抗性的方法，通过提取大豆基因组dna，用连接第一荧光标签的seq id no.1、连接第二荧光标签的seq id no.2和seqid no.3所示的kasp标记引物对提取的基因组dna进行竞争性等位基因特异性pcr扩增；荧光pcr仅检测到连接seq id no.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性品种；仅检测到连接seq id no.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性品种。所述的第一荧光标签和第二荧光标签如前所述。

7、本发明所采用的pcr扩增方法可以按照本领域的常规方法，在一些实施例中，本发明所述pcr扩增方法为：

8、pcr反应体系：dna2.5μl(浓度在10ng/μl左右)、seq 2x pcr mix 0.5μl、seq flu-arms 2x pcr mix 5μl、ddh2o 2μl。

9、pcr反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s、61-55℃梯度pcr，每次循环60s，每次降低0.6℃，共计10个循环；95℃复性20s、55℃复性及扩增60s，共35个循环。

10、所述的kasp 2x pcr mix包括上游引物seq id no.1(连接fam荧光标签)、上游引物seq id no.2(连接vic荧光标签)和通用下游引物seq id no.3。

11、进一步，所述kasp 2x pcr mix的配制：所设计的上游引物seq id no.1、上游引物seq id no.2和通用下游引物seq id no.3用te(ph 8.0)溶解至50μm，然后按照seq idno.1：seq id no.2：seq id no.3＝1:1:3的比例混合后上机，每10μl反应体系加0.5μlkasp 2x pcr mix。

12、再一方面，上述的大豆疫霉抗性鉴定的kasp分子标记在大豆疫霉抗性鉴定中的应用。

13、进一步，所述鉴定方法如下：

14、(1)获得待测样品基因组dna

15、(2)以基因组dna为模板，利用权力要求1所述的kasp分子标记引物进行竞争性等位基因特异性pcr反应扩增；

16、(3)pcr反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而鉴定出待测个体的疫霉抗性。

17、另一方面，上述的大豆疫霉抗性鉴定的kasp分子标记在辅助大豆育种中的应用。

18、与现有的技术相比，本发明具有如下改进之处：

19、1、在抗性基因附近开发紧密连锁的kasp分子标记。该标记应用到高通量技术可以实现大豆的疫霉抗性高效率、快速的鉴定及基因分型。在大豆苗期就能够及早鉴别大豆疫霉抗性植株。

20、2、通过对224份来源于中国大豆微核心种质资源，具有较高的遗传变异和较高的代表性，进行kasp基因分型，成功分型的个体有204个，鉴定准确的个体有173个，疫霉抗性鉴定检测有效性达98.55％，准确度达到84.80％，检测成功率高，抗性鉴定准确度高，对大豆疫霉抗性鉴定具有重要意义。

技术特征：

1.与大豆疫霉根腐病抗性紧密相关的kasp分子标记引物对，其特征在于包括连接第一荧光标签的上游引物seq id no.1、连接第二荧光标签的上游引物seq id no.2和通用下游引物seq id no.3。

2.根据权利要求1所述的分子标记引物对，其特征在于第一荧光标签为fam荧光标签，第二荧光标签为vic荧光标签。

3.根据权利要求1所述的分子标记引物对，其特征在于第一荧光标签为vic荧光标签，第二荧光标签为fam荧光标签。

4.权利要求1～3任一项所述的kasp分子标记引物对在鉴定大豆疫霉根腐病抗性或易感性中的应用；仅检测到连接seq id no.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接seq id no.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。

5.权利要求1～3任一项所述的kasp分子标记引物对在大豆疫霉根腐病抗性或易感性早期鉴定和筛选的分子育种中的应用；仅检测到连接seq id no.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接seq id no.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。

6.一种鉴定大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于：提取大豆基因组dna，用连接第一荧光标签的seq id no.1、连接第二荧光标签的seq id no.2和seq id no.3所示的kasp分子标记引物对提取的基因组dna进行竞争性等位基因特异性pcr扩增；荧光pcr仅检测到连接seq id no.1的第一荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病抗性种质；仅检测到连接seqid no.2的第二荧光标签信号的为大豆疫霉根腐病易感性种质。

7.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于：第一荧光标签为fam荧光标签，第二荧光标签为vic荧光标签。

8.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于：第一荧光标签为vic荧光标签，第二荧光标签为fam荧光标签。

9.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于，pcr反应体系：浓度在8～12ng/μl的dna 2.5μl、kasp 2x pcr mix 0.5μl、gude flu-arms 2x pcr mix 5μl、ddh2o 2μl；上游引物seq id no.1：上游引物seq id no.2：通用下游引物seq id no.3按照1:1:3的比例混合而成，每10μl反应体系加0.5μl kasp 2x pcr mix。

10.根据权利要求6所述的大豆疫霉根腐病抗性的方法，其特征在于，pcr反应程序：95℃预变性10min；95℃变性20s、61-55℃梯度pcr，每次循环60s，每次降低0.6℃，共计10个循环；95℃复性20s、55℃复性及扩增60s，共35个循环。

技术总结
本发明涉及农业生物技术领域，具体公开了一种用于大豆抗疫霉根腐病抗性鉴定的KASP分子标记及应用。所述KASP分子标记引物序列如上游引物SEQ ID No.1(连接FAM荧光标签)、上游引物SEQ ID No.2(连接VIC荧光标签)和通用下游引物SEQ ID No.3所示，该KASP分子标记能够实现对大豆疫霉根腐病抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型，鉴定检测有效性高达98.55％，准确度达到84.80％。

技术研发人员：郭娜,樊兴杏,孙睿东,赵晋铭,邢邯
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15