一种调控干细胞成骨分化的材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及一种仿生材料，具体地说，涉及一种调控干细胞成骨分化的材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着组织工程和再生医学的快速发展，通过模仿生命体本身的结构和特性开发能够治疗受损组织的方法，并且通过诱导间充质干细胞的治疗方式受到越来越大的关注。一方面，骨生长、改建及骨折愈合过程中都存在生理电势微环境，研究表明电刺激可以促进骨折的愈合，近年来铁电生物材料具有自发极化特性且无需外加电极即可形成局部刺激受到越来越多的关注，因此研究者通过铁电材料达到与内源性生理电位量级相匹配进而促进骨缺损区域的骨再生。现有研究主要是电场在二维层面上进行细胞培养并诱导其成骨分化，但是在这种培养模式下会改变细胞的形态并对细胞的功能分化有一定的影响。因此考虑制备三维空间电学微环境培养细胞并诱导干细胞成骨分化。
3.研究证实，电刺激可以诱导干细胞成骨分化并促进缺损处骨再生，同时骨组织的三维空间微纳结构特性也早已进行了报道，为了克服二维细胞培养的缺点，结合骨组织的空间结构特性，我们制备了三维微观拓扑结构复合带电特性的材料体系，有望在实现缺损处骨再生的前提下，达到更优的仿生设计，同时提高成骨性能及成骨细胞的粘附和在三维空间的生长。
4.公开号为cn107075476b的中国专利申请公开了使用水凝胶诱导干细胞三维成骨分化的方法，其先将多孔膜以非接触方式置于细胞培养容器内，然后在所述多孔膜的一个表面上施加包括5-15％水凝胶的水凝胶溶液以通过溶胶-凝胶相转变在其上包被水凝胶。该方法可以显著缩短成骨分化的诱导期，并且具有细胞在分化后也容易分离的效果，但是合成生物凝胶会逐渐发生生物降解，生物活性随之降低。
5.公开号为cn107213529a中国专利申请公开了一种用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料的制备方法，其主要是将可降解医用高分子材料与促进成骨细胞粘附和增殖的活性物复合，制备具有三维结构的薄膜；对三维结构的薄膜进行表面功能化处理；采用具有骨细胞粘附和增殖活性的活性物对表面功能化处理的三维结构的薄膜进行表面改性；将表面改性后的三维结构的薄膜进行洗涤、干燥后得到产品。通过上述方法制备的用于提高成骨细胞粘附和成骨性能的可降解医用高分子三维材料能够保持力学性能和结构，通过混合改性和表面修饰方法能够实现体相低浓度持久表达和表面高浓度短时间表达成骨活性物的结合，明显提高成骨细胞的粘附和三维生长，但是没有实现明确的成骨诱导效果，同时随着医用高分子三维材料的降解，其诱导细胞粘附和生长的能力下降。


技术实现要素：

6.本发明就是为了解决现有材料生物活性较低、成骨诱导效果不好的技术问题，提
供一种生物活性高、成骨诱导效果好的调控干细胞成骨分化的材料及其制备方法和应用。
7.为此，本发明提供一种调控干细胞成骨分化的材料，其含有基质，所述基质为压电陶瓷片，所述压电陶瓷片的材料为自发极化性能的铁电陶瓷颗粒；所述基质上设有凸起，所述凸起形成三维微观拓扑形貌；所述凸起的高度为20～80μm。
8.优选的，所述铁电陶瓷颗粒包括钛酸钡、钛酸锶钡、铁酸铋、铌酸钾钠、铌酸锂中的一种或多种。
9.优选的，所述凸起的高度为50μm。
10.本发明同时提供一种调控干细胞成骨分化的材料的制备方法，其包括如下步骤：(1)取铁电陶瓷颗粒进行压实、烧结处理形成铁电陶瓷片； (2)将所述步骤(1)中得到的铁电陶瓷片，采用激光、微弧氧化、机械加工、喷砂、酸蚀处理中的一种或多种，形成凸起，在铁电陶瓷片形成三维微观拓扑形貌。
11.本发明还提供一种调控干细胞成骨分化的材料在调控干细胞成骨分化中的应用。
12.优选的，将具有三维微观拓扑形貌的铁电陶瓷片进行空间电场功能化处理，形成具有不同压电响应的空间微环境。
13.优选的，所述空间电场功能化处理，是将三维结构的铁电陶瓷片置于极化场强为0.1kv/mm～10kv/mm、极化介质为空气、甲基硅油两种中的一种，极化温度为25℃～100℃，处理1min～60min。
14.本发明具有以下有益效果：
15.研究表明，对铁电陶瓷颗粒进行压实、烧结和激光切割是决定形成三维微观形貌压电陶瓷片的关键因素，为了实现铁电陶瓷颗粒能够压实、烧结成型，同时保持三维空间电学微环境的长期稳定性，本发明将铁电陶瓷颗粒与基质结合进行压实、烧结和激光切割等处理。
16.三维空间电学微环境中空间结构的差异会产生不同的压电响应，进而对干细胞成骨诱导分化产生不同的影响。为了使具备三维拓扑空间结构的压电陶瓷片获得更好的生物活性，并达到仿生量级的电活性，发明人采用具有自发极化特性且无需外加电极即可形成局部电刺激的铁电陶瓷纳米颗粒，通过压实、烧结和激光切割形成不同空间结构的拓扑形貌，并通过空间电场功能化处理，形成了具有不同压电响应的三维空间电学微环境。
17.最终比较了具有不同压电响应的三维空间电学微环境对干细胞成骨分化的影响，优化出柱高50μm具有最高的压电响应性且诱导干细胞成骨分化作用最好，证实了具有三维空间电学微环境的材料促进干细胞成骨分化的可行性和有效性。
18.(1)本发明首先取一定质量的铁电陶瓷颗粒进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片，然后采用激光、微弧氧化、机械加工、喷砂、酸蚀处理中的一种或多种，在铁电陶瓷片上形成三维微观拓扑形貌，在此基础上，对三维微观形貌的铁电陶瓷片进行空间电场功能化处理，形成具有不同压电响应的空间电微环境，同时具备了骨的仿生结构和电学特性，形成了结合稳定性优良、促进干细胞成骨分化的三维空间电学微环境。
19.(2)本发明制备的具有三维微观拓扑结构的材料属于不可降解型，材料能够保持长期稳定的电学特性，同时可以避免因材料降解引起的离子析出并被人体吸收等潜在的危害身体的问题。
20.(3)本发明制备的材料由于其内在的铁电特性，通过空间电场功能化处理后可以
具备不同的压电响应性，既定的空间电学微环境可以实现可控的干细胞成骨分化效果。
21.(4)本发明的三维空间电学微环境调控干细胞成骨分化技术可以实现干细胞三维空间上的粘附、生长分化和成骨诱导。
22.(5)本发明的制备工艺简单，操作简便，可以实现批量生产及临床上推广应用。
23.综上所述，本发明所提供的三维空间电学微环境调控干细胞成骨分化技术的基础实验效果明确并且在临床应用上可操作性强，在干细胞成骨分化过程中，不仅呈现出良好的生物相容性而且表现出优异的电学稳定性，同时为骨再生提供适宜的空间电学微环境，在考虑仿生量电学特性的同时也考虑了骨的结构特性，进一步实现了精确调控干细胞的成骨分化，更深层次的改善了诱导成骨适配性、临床操作和预后等方面。
附图说明
24.图1为本发明实施例3中三维空间拓扑微观形貌的sem图；
25.图2为本发明实施例3中柱高为20μm的三维空间拓扑微观形貌的白光衍射图；
26.图3为本发明实施例3中柱高为50μm的三维空间拓扑微观形貌的白光衍射图；
27.图4为本发明实施例3中柱高为80μm的三维空间拓扑微观形貌的白光衍射图；
28.图5为本发明实施例3所述压电陶瓷片压电性能示意图；
29.图6为本发明实施例3所述压电陶瓷片压电性能的定量分析示意图；
30.图7为本发明实施例3所述压电陶瓷片的电学稳定性测试结果示意图；
31.图8a、图8b、图8c分别为本发明实例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境调控干细胞成骨分化的细胞形状sem图像；
32.图9为本发明实施例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境调控干细胞成骨分化的骨形态发生蛋白(bmp2)的免疫荧光图像；
33.图10为本发明实施例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境调控干细胞成骨分化的骨形态发生蛋白(bmp2)的平均荧光强度定量分析示意图；
34.图11为本发明实施例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境调控干细胞成骨分化的骨形态发生蛋白(bmp2)的rt-qpcr定量分析示意图；
35.图12a、图12b分别为本发明实施例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境促进骨再生的micro ct图像(a)和成骨相关指标的定量分析(b)示意图；
36.图13为本发明实施例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境促进骨再生的h&e染色图像；
37.图14为本发明实施例3所述具有不同压电响应的三维空间电微环境促进骨再生的masson染色图像；
38.图15a为本发明对比例1所述表面平滑的压电陶瓷片调控干细胞成骨分化的细胞形状sem图像；
39.图15b为本发明对比例2所述具有电活性的二维钛酸钡纳米复合膜调控干细胞成骨分化的细胞形状sem图像；
40.图16为本发明对比例2所述具有电活性的二维钛酸钡纳米复合膜的 micro ct图像。
具体实施方式
41.下面结合实施例对本发明做进一步描述。
42.实施例1
43.(1)取铁电陶瓷颗粒铁酸铋进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片；
44.(2)形成三维微观形貌的铁电陶瓷片需要采用微弧氧化处理，在铁电陶瓷片上形成柱高为100nm、500nm和1μm的三维微观拓扑形貌；
45.(3)对三维微观形貌的压电陶瓷片进行清洗、超声、干燥。之后进行空间电场功能化处理，具体是将三维结构的陶瓷片置于极化场强为0.1 kv/mm、极化介质为空气，极化温度为25℃，处理60min，形成具有不同压电响应的空间微环境；
46.通过以上步骤所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料的主要成分是铁酸铋纳米铁电陶瓷颗粒，形成柱高为100nm、500nm和1μm的三维微观拓扑形貌。
47.(4)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料上，经过成骨诱导一天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，另外通过实施例1制备的材料诱导干细胞成骨分化一天后通过免疫荧光显微镜和实时荧光定量pcr技术重点观察成骨指标(骨形态发生蛋白)蛋白和基因含量的变化，之后将通过实施例1制备的材料应用于大鼠颅骨临界骨缺损处，通过micro ct及成骨相关指标的定量分析、h&e染色和 masson染色观察四周时的骨再生效果。
48.实施例2
49.(1)取铁电陶瓷颗粒钛酸锶钡进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片；
50.(2)形成三维微观形貌的铁电陶瓷片需要采用机械加工处理，在铁电陶瓷片上形成柱高为20μm、80μm和150μm三维微观拓扑形貌；
51.(3)对三维微观形貌的压电陶瓷片进行清洗、超声、干燥。之后进行空间电场功能化处理，具体是将三维结构的陶瓷片置于极化场强为0.5 kv/mm、极化介质为空气，极化温度为37℃，处理50min，形成具有不同压电响应的空间微环境；
52.通过以上步骤所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料的主要成分是钛酸锶钡纳米铁电陶瓷颗粒，形成柱高为20μm、80μm和150μm 的三维微观拓扑形貌。
53.(4)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料上，经过成骨诱导七天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，另外通过实施例1制备的材料诱导干细胞成骨分化七天后通过免疫荧光显微镜和实时荧光定量pcr技术重点观察成骨指标(骨形态发生蛋白)蛋白和基因含量的变化，之后将通过实施例1制备的材料应用于大鼠颅骨临界骨缺损处，通过micro ct及成骨相关指标的定量分析、h&e染色和masson染色观察三个月时的骨再生效果。
54.实施例3
55.(1)取铁电陶瓷颗粒钛酸钡进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片；
56.(2)形成三维微观形貌的铁电陶瓷片采用激光处理，在铁电陶瓷片上形成柱高为20μm、50μm和80μm三维微观拓扑形貌；
57.(3)对三维微观形貌的压电陶瓷片进行清洗、超声、干燥。之后进行空间电场功能化处理，具体是将三维结构的陶瓷片置于极化场强为1 kv/mm、极化介质为空气，极化温度为37℃，处理30min，形成具有不同压电响应的空间微环境；
58.通过以上步骤所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料的主要成分是钛酸钡纳米铁电陶瓷颗粒，形成柱高为20μm、50μm和80μm的三维微观拓扑形貌。
59.(4)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料上，经过成骨诱导七天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，另外通过实施例1制备的材料诱导干细胞成骨分化一天后通过免疫荧光显微镜和实时荧光定量pcr技术重点观察成骨指标(骨形态发生蛋白)蛋白和基因含量的变化，之后将通过实施例1制备的材料应用于大鼠颅骨临界骨缺损处，通过micro ct及成骨相关指标的定量分析、h&e染色和 masson染色观察四周时的骨再生效果。如附图所示为本实施例检测结果，扫描电子显微镜结果显示，成骨诱导七天后，柱高50μm形成的三维空间电学微环境能诱导干细胞呈多角形样铺展，并且具有更多的丝状伪足样结构(图8b)，而柱高20μm和柱高80μm形成的三维空间电学微环境则没有诱导干细胞形成典型的成骨细胞样形态(图8a和8c)。同时成骨诱导一天后的免疫荧光图像和pcr定量结果也显示了相同的趋势。免疫荧光结果显示柱高50μm形成的三维空间电学微环境诱导干细胞表达更高的bmp2(图9)同时定量结果也显示这组具有更高的bmp2蛋白含量(图10)，实时荧光定量pcr也显示柱高50μm形成的三维空间电学微环境的bmp2基因表达量更高(图11)。micro ct结果显示(图12a)，材料植入体内四周后，柱高50μm形成的三维空间电学微环境明显促进骨再生，同时定量结果也显示这组具有更高的骨体积分数(图12b)。h&e 染色(图13)和masson染色(图14)图像也显示了相同的趋势，柱高 50μm形成的三维空间电学微环境可以更快的诱导新骨形成。
60.实施例4
61.(1)取铁电陶瓷颗粒铌酸钾钠进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片；
62.(2)形成三维微观形貌的铁电陶瓷片需要进行采用喷砂处理，在铁电陶瓷片形成柱高为100nm、200nm和500nm三维微观拓扑形貌；
63.(3)对三维微观形貌的压电陶瓷片进行清洗、超声、干燥。之后进行空间电场功能化处理，具体是将三维结构的陶瓷片置于极化场强为5 kv/mm、极化介质为空气，极化温度为25℃，处理15min，形成具有不同压电响应的空间微环境；
64.通过以上步骤所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料的主要成分是铌酸钾钠纳米铁电陶瓷颗粒，形成柱高为100nm、200nm和500nm 的三维微观拓扑形貌。
65.(4)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料上，经过成骨诱导一天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，另外通过实施例1制备的材料诱导干细胞成骨分化七天后通过免疫荧光显微镜和实时荧光定量pcr技术重点观察成骨指标(骨形态发生蛋白)蛋白和基因含量的变化，之后将通过实施例1制备的材料应用于大鼠颅骨临界骨缺损处，通过micro ct及成骨相关指标的定量分析、h&e染色和 masson染色观察三个月时的骨再生效果。
66.实施例5
67.(1)取铁电陶瓷颗粒铌酸锂进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片；
68.(2)形成三维微观形貌的铁电陶瓷片进行采用酸蚀处理，在铁电陶瓷片形成柱高为10μm、20μm和50μm三维微观拓扑形貌；
69.(3)对三维微观形貌的压电陶瓷片进行清洗、超声、干燥。之后进行空间电场功能化处理，具体是将三维结构的陶瓷片置于极化场强为0.5 kv/mm、极化介质为甲基硅油，极化温度为100℃，处理30min，形成具有不同压电响应的空间微环境；
70.通过以上步骤所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料的主要成分是铌酸锂纳米铁电陶瓷颗粒，形成柱高为10μm、20μm和50μm的三维微观拓扑形貌。
71.(4)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有三维空间电学微环境的仿生材料上，经过成骨诱导七天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，另外通过实施例1制备的材料诱导干细胞成骨分化一天后通过免疫荧光显微镜和实时荧光定量pcr技术重点观察成骨指标(骨形态发生蛋白)蛋白和基因含量的变化，之后将通过实施例1制备的材料应用于大鼠颅骨临界骨缺损处，通过micro ct及成骨相关指标的定量分析、h&e染色和 masson染色观察四周时的骨再生效果。
72.对比例1
73.(1)取铁电陶瓷颗粒钛酸钡进行压实、烧结等处理形成铁电陶瓷片；
74.(2)对表面平滑压电陶瓷片进行清洗、超声、干燥。之后进行空间电场功能化处理，具体是将表面平滑的陶瓷片置于极化场强为1kv/mm、极化介质为空气，极化温度为37℃，处理30min，形成具有压电响应的表面平滑的陶瓷片；
75.(3)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有压电响应的二维电学微环境的仿生材料上，经过成骨诱导七天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，结果显示具有压电响应的表面平滑的陶瓷片不能诱导干细胞呈成骨细胞样多角形样铺展，同时显示形成较少的丝状伪足样结构。
76.对比例2
77.(1)配制浓度为0.01mol/l的多巴胺水溶液，将钛酸钡纳米陶瓷颗粒超声振荡分散在多巴胺水溶液中，在水浴条件下搅拌、离心和洗涤，得到具有多巴胺包覆层的钛酸钡纳米陶瓷颗粒填料；
78.(2)将处理后的钛酸钡纳米陶瓷颗粒和p(vdf-trfe)聚合物溶解在 dmf有机溶剂中，采用超声振荡结合搅拌形成稳定混悬液；
79.(3)之后浇铸成膜，将所得膜材料加热烘干，使溶剂完全挥发得到具有电活性的二维钛酸钡纳米复合膜。
80.(4)将骨髓来源间充质干细胞以一定的数量接种在上述所得的具有电活性的二维钛酸钡纳米复合膜的仿生材料上，经过成骨诱导一天后通过场发射-扫描电子显微镜(fe-sem)观察骨髓来源间充质干细胞形态的变化，结果显示具有电活性的钛酸钡纳米复合膜在二维状态下不能更好的诱导干细胞形成典型的成骨细胞样形态。同时micro ct结果显示(图 16)，材料植入体内四周后，具有电活性的钛酸钡纳米复合膜在二维状态下形成较少的新生骨质。
81.惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。