一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.长期以来的砷矿开采、炼砷、农药化肥施用和污水灌溉等生产活动，使类金属砷在土壤环境中富集，造成土壤砷污染问题。由于水稻植株易吸收和累积砷，稻米成为人体慢性暴露于砷的主要途径，对人体健康构成严重威胁。稻田季节性水分管理改变土壤氧化还原电位，同时砷形态和移动性发生显著变化。稻田落干条件下砷主要为五价砷酸盐，强烈吸附于铁铝等氧化物表面，限制了砷的移动性。当稻田处于淹水状态时，五价砷酸盐被还原为三价亚砷酸盐，砷毒性增加25-60倍。因为亚砷酸吸附于土壤固相的强度比砷酸盐低，亚砷酸从固相中解吸出来，其含量占到土壤溶液中砷含量的70%-90%。因此，淹水稻田中砷的还原释放，增加了砷的生物毒性和生物有效性，加重了砷的毒害，抑制了水稻等作物对营养元素的吸收及其生长。因此，亟需研发有效降低土壤中无机砷含量，并抑制作物对无机砷的吸收的关键技术，保障土壤与农产品的安全。
3.淹水稻田还原条件下释放亚砷酸能促进微生物砷甲基化，产物中二甲基砷和三甲基砷的毒性分别比亚砷酸小约100和1000倍。砷甲基化从以下两个方面降低了稻田砷的毒害：一方面，降低稻米中砷的毒性；水稻籽粒的二甲基砷可以占到其总砷量的0%-90%，土壤微生物砷甲基化增加籽粒中砷甲基砷的比例，降低无机砷的比例，从而有效降低籽粒中总砷的毒性提高农产品安全（世界农产品质量标准仅将无机砷列为控制对象）。另一方面，降低土壤中生物可利用态砷的含量；在微生物逐步砷甲基化过程中，中间产物甲基亚砷酸在胞内还原酶催化下生成挥发性甲基砷，主要为三甲基砷。砷甲基化有利于砷的挥发，将实现砷从稻田土壤中的去除，从而实现砷的去除。因此，砷甲基化是微生物对土壤砷的一种重要解毒过程。
4.稻田土壤中砷甲基化微生物具有物种多样性，其中好氧砷甲基化功能菌生长速度快，其砷甲基化效率远大于厌氧菌。cn201510956127.5鉴定了一株嗜纤维菌科的好氧砷甲基化细菌sm-1，但该菌仅能在r2a培养基中生长，且无法在lb等培养基中生成，具有明显的局限性。同时，该菌的适应的砷浓度较低，不利于广泛应用。此外，上述知识产权保护的菌株仅具有砷甲基化功能，对作物营养物质以及生长并不具有改善和促进作用，因此功能较为单一。鉴于当前砷甲基化菌资源的极度短缺，亟需发掘新型的砷甲基化功能微生物菌种。因此，分离获得稻田土壤中好氧砷甲基化和挥发功能菌，对利用微生物技术解决我国环境具有重要的应用价值与意义，也有助于提升我国环境微生物治理技术的核心竞争力。


技术实现要素：

5.为解决相关问题，本发明的第一个目的在于提供一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的芽孢杆菌。
6.本发明的第二个目的在于提供上述具有好氧砷甲基化和挥发功能的芽孢杆菌的应用。
7.本发明的目的通过如下技术方案实现：一株具有好氧砷甲基化和挥发功能的芽孢杆菌，名称为芽孢杆菌（bacillus acidiceler）lh14，其于2021年12月2日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为：gdmcc no：62092。
8.所述的芽孢杆菌lh14的应用，将所述的芽孢杆菌lh14置于含有无机三价砷的环境中培养，实现砷甲基化，或同步实现砷甲基化与砷氧化。
9.进一步地，所述的甲基化为二甲基化和/或三甲基化。
10.进一步地，所述的无机三价砷为亚砷酸和/或亚砷酸盐。
11.进一步地，所述的无机三价砷在环境中的浓度范围为0～100μmol/l；优选为0～50μmol/l；更优选为0～20μmol/l。进一步地，所述的环境包括但不限于培养基、土壤和水体。
12.进一步地，所述的培养基为r2a培养基、lb培养基和tgy培养基中的任意一种。
13.进一步地，所述的r2a培养基的配方为：胰蛋白胨0.3～0.4g/l，酸水解酪蛋白0.4～0.6g/l，酵母浸粉0.4～0.6g/l，可溶性淀粉0.4～0.6g/l，磷酸氢二钾0.2～0.4g/l，硫酸镁0.05～0.15g/l，丙酮酸钠0.2～0.4g/l，蛋白胨0.2～0.3g/l，葡萄糖0.4～0.6g/l，余量为水，ph 7.2
ꢀ±ꢀ
0.2；优选为胰蛋白胨0.35g/l，酸水解酪蛋白0.5g/l，酵母浸粉0.5g/l，可溶性淀粉0.5g/l，磷酸氢二钾0.3g/l，硫酸镁0.1g/l，丙酮酸钠0.3g/l，蛋白胨0.25g/l，葡萄糖0.5g/l，余量为水，ph 7.2
ꢀ±ꢀ
0.2。
14.进一步地，所述的lb培养基的配方为：9～11g/l蛋白胨，4～6g/l酵母粉，9～11g/l nacl，余量为水；优选为：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l nacl，余量为水。
15.进一步地，所述的tgy培养基的配方为：4～6g/l胰蛋白胨，4～6g/l酵母粉，0.05～0.15g/l葡萄糖，0.05～0.15g/l k2hpo4，余量为水；优选为：5g/l胰蛋白胨，5g/l酵母粉，1g/l葡萄糖，1g/l k2hpo4，余量为水。
16.进一步地，当所述的环境为培养基时，所述的芽孢杆菌lh14的接种量按细菌细胞密度od600=0.01计。
17.进一步地，所述的培养的条件为温度28～32℃、转速150～250rpm、时间4～6天；优选为温度30℃、转速200rpm、时间5天。
18.一种具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂，含有培养基和所述的芽孢杆菌lh14。
19.进一步地，所述的培养基为r2a培养基、lb培养基和tgy培养基中的任意一种。
20.上述具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂的制备方法，在培养基中接种所述的芽孢杆菌lh14，震荡培养，得到具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂。
21.进一步地，所述的培养的条件为温度28～32℃、转速150～250rpm、时间8～14 h；优选为温度30℃、转速200rpm、时间10～12 h。
22.上述具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂在砷污染环境修复中的应用。
23.进一步地，所述的环境包括但不限于水体和土壤。
24.进一步地，所述的应用的具体操作为：将所述的具有好氧砷甲基化和挥发功能的微生物制剂置于待修复的环境中培养即可。
25.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的芽孢杆菌lh14对无机三价砷具有明显的甲基化作用，主要甲基砷产物为三甲基砷，其次为二甲基砷，并不产生一甲基砷（毒性相对其他有机胂更高）。此外，该lh14还可同步实现砷甲基化与砷氧化的双解毒功能。可见，芽孢杆菌lh14可以明显的降低剧毒无机砷的含量，产生毒性较低的有机砷和挥发性的砷，以及无机砷里面移动性更低、毒性更弱的五价砷。在砷污染环境治理和修复，尤其是砷污染土壤治理和修复中具有重要应用潜力。
26.本发明提供的芽孢杆菌可具有良好的植物促生作用，在砷胁迫下接种lh14后，有助于水稻种子在含无机三价砷的环境中的种子萌发与生长。
27.本发明进一步确定了芽孢杆菌lh14调控砷甲基化的最佳培养底物。
附图说明
28.图1为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在na培养基上的菌落形态图。
29.图2为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14对数期细胞形貌扫描电镜图（tem）。
30.图3为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14对数期细胞形貌透射电镜图（tem）。
31.图4为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14砷甲基转移酶arsm的系统发育树图。
32.图5为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在含砷r2a、lb和tgy培养基中的甲基砷产生效率分析结果图。
33.图6为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在含不同砷浓度的培养基中的生长曲线图。
34.图7为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在含砷r2a、lb和tgy培养基中72小时内的砷挥发累积量分析结果图。
35.图8为接种砷甲基化功能芽孢杆菌lh14的水稻种子发芽情况图。
36.图9为砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在土壤中促进亚砷盐转化的效果图。
具体实施方式
37.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
38.实施例1：砷甲基化功能芽孢杆菌lh14的分离和鉴定样品采集自广东省汕头市莲花山砷污染稻田土壤。称取经自然风干且过10目筛的土壤样品100g于250ml锥形瓶，加入灭菌超纯水100ml，用透气膜封住瓶口，于室温下静置培养15天对土壤微生物进行活化。用灭菌超纯水对土壤悬浊液进行梯度稀释，浓度梯度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
和10-7
，分别取100μl浓度为10-4
、10-5
、10-6
和10-7
的稀释液涂布于含20μm亚砷酸的st10-1
固体培养基平板上。st10-1
固体培养基配方如下：胰蛋白胨0.5g，酵母提取液0.05g，葡萄糖0.5g，定容至1000ml，于121℃高温高压灭菌20min。用0.22μm孔径滤膜对12mm亚砷酸储备液过滤除菌后，添加1.7ml储备液至1000ml培养基中，使亚砷酸终浓度为20μm。将涂布后的平板倒置于30℃培养箱中培养72h，挑取形态特征有明显区别的单菌落接种于含10μm亚砷酸的100mlr2a培养基。r2a液体培养基配方如下：胰蛋白胨0.35g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.25g，葡萄糖0.5g，ph 7.2，加水定容至1000 ml，于121℃高温高压灭菌
20min。单菌落接种培养72h后，用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪（hplc-icp-ms，perkinelm）检测培养液中的一甲基砷、二甲基砷、三甲基砷、亚砷酸和砷酸含量，选择有甲基砷生成的菌液进行平板划线纯化，经三次纯化后获得一株具有砷甲基化功能的菌株。
39.形态特征分析：该菌株为革兰氏阳性菌，有内生孢子形成，无游动性，末端钝圆杆状（约0.9
×
10），呈分枝状和短链状排列。如图1所示，该菌株在na琼脂培养基上培养48h时，菌落呈现灰白色，圆形，表面略粗糙，边缘整齐，菌体单个、成对或链状排列，有芽孢，芽孢呈椭圆形，近端生。菌落衰老时表面粗糙而且出现火山坑或脐状凹陷。扫描电镜（sem）图2显示该菌株整体形貌呈杆状，末端钝圆（约0.9
×
3μm）。图3的透射电镜结果显示，菌株lh14呈短杆状，末端钝圆，有内生芽孢，细胞平均长约1μm
±
0.3μm，宽0.5μm
±
0.1μm。
40.生理生化特征分析：该菌株可在na、r2a、lb、tsb和tgy培养基中30℃好氧生长。接触酶（过氧化氢酶试验）呈阳性，说明该菌株具有催化过氧化氢分解为分子态氧从而解毒的能力。氧化酶呈阳性，说明菌株具备细胞色素氧化酶，其使细胞色素c氧化为氧化型细胞色素c，后者氧化苯二胺从而显色。硝酸盐还原呈阳性，表明菌株具有硝酸还原酶，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。vp实验中，丙酮酸能经脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下被氧化为二乙酰，进一步与含有胍基的精氨酸等化合物结合，形成红色的化合物，结果呈阳性，即该菌株能分解葡萄糖生成丙酮酸。明胶液化呈阴性，说明该菌株无明胶酶活性，不具备使明胶液化的功能。淀粉水解呈阴性，即菌株不能产生淀粉酶，不能将淀粉分解为葡萄糖。该菌株能水解七叶灵和酪蛋白，不能利用脲酶和柠檬酸盐。吲哚产生阴性，即菌株不能分解蛋白质中的色氨酸，无法产生靛基质（吲哚）。酶活性方面，2-硝基苯基-β-d-吡喃半乳糖苷（onpg）实验阴性，表明该菌株无β-半乳糖苷酶活性，不能发酵乳糖，也不具备精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶活性。碳源利用方面，该菌株可以利用葡萄糖、甘油、甘露醇、甘露糖和麦芽糖产酸，不能利用松二糖、核糖产酸。
41.基因组和arsm基因序列分析：采用细菌dna提取试剂盒（dneasy blood & tissue kit, qiagen, valencia, ca）提取该菌株的基因组dna，并将其送至上海派森诺生物科技有限公司进行全基因组测序。将该菌株的16s rrna基因片段序列（长度为1387bp，序列如seq id no.1所示），利用blast在genbank中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，结果表明该好氧砷甲基化菌株为芽孢杆菌属，与gottfriediaacidiceleris（曾用名bacillus acidiceler）的相似性达99.93%。该菌株基因组gc含量为32.91%，其与模式菌株gottfriediaacidicelerisdsm 18954
t
基因组的平均核苷酸一致性（ani）为99.98%。通过基因组草图测序获得的砷甲基转移功能基因arsm序列长度为795bp（序列如seq id no.2所示），利用blastx将其与genbank的nr数据库中非冗余蛋白质序列进行同源性比较，结果显示该菌株arsm基因编码的蛋白序列与bacillus cereus的同源性为70.79%。将该菌株砷甲基转移酶arsm的蛋白质序列与和其他bacillus属及目前已鉴定的arsm，在mega软件中通过muscle算法进行多重比对，删除比对后序列前后空位，通过邻接法构建系统发育树。从图4中树的拓扑结构可以看出，该菌株砷甲基转移酶与bacillus cereus和bacillus thuringiensis有显著同源关系。
42.综合形态特征、生理生化特征、基因序列分析结果，初步判断该菌株为芽孢杆菌bacillus，将该菌株命名为芽孢杆菌（bacillus acidiceler）lh14，并于2021年12月2日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心
（gdmcc），保藏编号为：gdmcc no：62092。
43.16s rrna基因序列（seq id no.1）：cggactaatgggagcttgctcccagttagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctacctgtaagactgggataacttcgggaaaccggagctaataccggatgacataaaggaactcctgttcctttattgaaagatggcttcggctatcacttacagatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagcgatgaaggccttcgggtcgtaaagctctgttgttagggaagaataagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagtggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatagtacaaagggttgcaagaccgcgaggtggagctaatcccataaaactattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcactagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggt。
44.arsm基因序列（seq id no.2）：atgaaagaattagaaaaagatagtatccgccaaacagtgcgtgataattataaaaaggttgctttaaatgtattggaaaaagactgctgtggaacgactgactgctgctcttccactgataatacgttaagtaactacacaaataaactagggtattcaaatgaggagctacaatcagtccctgagggatcgaacatggggctaggatgtggaaatccacaagctattgcaaacattaaacctgaagaaactgtacttgatttaggaagcggtggaggatttgattgttttctagctgcacgcaaagttggtgaaagtggaagagtaattggagttgatatgactcctgaaatgattagtaaagcaagattaaatgcagagaaaaattcatttaaaaatgttgaattccgattaggtgagatagaaaatttaccagttgctaatgactctgtcgatgttattatttcgaactgtgtaattaatttatcaccagataaaaatcgtgtttttcaagaagcataccgtgtattgaaaaaaggtggacgcttagctatttctgatattgttctcacagctgatttacctgatgatattcgtaatgacttgagcttctattcagggtgtatttcaggatcttcttatattaaagatttagagcagtaccttcaattggcaggatttaatgcaataaggattgttccaaaagatgattcacatgagtttattaaggaatgggcaccaggtcgtaatgtacaggattatattgtctcagcagtgattgaagcagttaaataa。
45.实施例2：砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在含砷r2a、lb和tgy培养基中的砷甲基化效率用lb液体培养基对lh14进行扩大培养后用于砷甲基化效率验证。具体如下：配制灭菌lb液体培养基500ml，其配方为10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，10g/l nacl，余量为水；将划线平板中单菌落接种至培养基中震荡培养（30℃，200rpm）10小时-12小时，其od600为0.4-0.5，处于对数期中期。扩大培养的菌液在5000rpm条件下离心10min进行菌体收集。取
0.55ml lh14菌液（od600=1.8）分别接种在含12μm亚砷酸的100ml灭菌r2a、lb和tgy液体培养基中。tgy液体培养基配方为5g/l胰蛋白胨，5g/l酵母粉，1g/l葡萄糖，1g/l k2hpo4，余量为水。反应初始菌液od600为0.01，培养液于30℃、200rpm恒温震荡条件下培养5天，分别在培养第1、2、3、4和5天将不同培养基中液体样品经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用hplc-icp-ms进行砷形态测定。
46.如图5所示，菌株lh14在r2a、lb和tgy培养基中对12μm亚砷酸有明显的甲基化作用。在三种培养基中，三甲基砷和二甲基砷浓度随培养时间增加而增加，同时无机亚砷酸浓度随时间增加而降低。培养第2天时，tgy中甲基砷效率最高，其次为lb和r2a，第2天后甲基砷生成趋于稳定。5天反应结束后，r2a、lb和tgy培养基中亚砷酸转化为甲基砷比例分别为24%、44%和50%。主要甲基砷产物在三种培养基中都为三甲基砷，占总甲基砷比例为53%-92%，特别是在lb和tgy条件下，毒性更低的三甲基砷占总甲基砷比例分别达到了83%、92%，具有显著降低无机亚砷酸毒性的能力，并不产生有机砷内毒性最高的一甲基砷，性能优于现已报道的砷甲基化菌种。同时，除了砷甲基化的功能之外，该lh14菌株在lb和tgy的情况下，还具有同步氧化亚砷酸为在土壤中移动性更小、毒性较亚砷酸更低的砷酸（即五价无机砷）的功能，可实现同步砷甲基化与砷氧化的解毒功能。上述结果表明，lh14在不同的培养基条件下，均具有砷甲基化功能，尤其是在tgy培养基中砷甲基化效率较高，尤其以毒性更低三甲基砷为主，并兼具氧化亚砷酸为砷酸的能力。此外，虽然lb培养基中的砷甲基化率略低于tgy，但其营养组分含量低于tgy，证明了该菌株lh14在相对营养较少的条件下，仍然具有高效的砷甲基化率能力。
47.实施例3：砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在含不同砷浓度的lb培养基中的生长曲线分析。
48.菌株接种于含0、20、50μm的亚砷酸的lb培养基，反应培养5天；在不同的培育时间点，吸取适量的培养物加入到离心管中，经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用hplc-icp-ms进行砷形态测定。
49.如图6所示，菌株lh14在不同浓度的as(iii)浓度的培养基中，砷甲基化功能芽孢杆菌lh14生长延滞期随as(iii)浓度增加而增大，其生长至对数期所需时长从14小时增加至30小时。但培养50小时之后，其生物量在50μm亚砷酸的条件下培养，最终生物量（od600值）为0.30，略低于空白对照组（即无砷条件）的生物量（0.43），说明该菌株lh14对as(iii)表现出良好的耐受能力。
50.实施例4：砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在含砷r2a、lb和tgy培养基中的砷挥发效率配制120ml含12μm无机亚砷酸的r2a、lb和tgy培养基分别于500ml的磨口集气玻璃瓶。挥发性砷的收集装置是由500ml磨口玻璃瓶、通气接口和捕集器组成，通气接口有两个，一个是鼓风通气，另一个是由锡箔纸包裹着的1ml枪头，枪头两端为石英棉，中部填充物为经1%agno3浸泡过夜的35-60目高纯硅胶粒，起着排气和氧化捕获挥发性砷的作用。反应初始菌液od600为0.01，培养置于30℃，200rmp摇床，培养三天，分别在9h、20h、44h、64h和72h回收捕集头。为了收集完全玻璃瓶内和培养物中的挥发性砷，每次需要从进气口鼓风20分钟，间歇性晃动玻璃瓶，结束后更换新的捕获器。取出回收捕集枪头内的硅胶粒，在2ml 0.5（v/v）hno3中90℃回流消煮洗脱2小时，洗脱后的溶液经hplc-icp-ms测定砷形态和含量。由于实验中能检测到的挥发性砷只有三甲基砷，含agno3浸泡的硅胶颗粒能将三甲基砷氧化
为三甲基砷氧化物。因此，洗脱液中的砷含量代表着三甲基砷含量。
51.菌株lh14在r2a、lb和tgy培养基中72h内皆有挥发性砷产生。如图7所示。随着反应时间的增加，总挥发性砷产量逐渐升高。挥发性甲基砷产物形态为三甲基砷，无其他挥发性砷形态检出。反应72h后，r2a、lb和tgy培养基中挥发性甲基砷以三甲基砷为主，砷的挥发率分别达到了0.71%、0.51%和0.81%。说明菌株lh14具有砷挥发能力，且在tgy培养基中的砷挥发效率较高。
52.实施例5：促生作用耦合砷甲基化为了考察砷甲基化功能芽孢杆菌lh14分别在有无砷胁迫下的植物促生效果，以水稻种子为对象，测定不同as(iii)浓度条件和有无lh14接种对水稻种子发芽数和芽长的影响。
53.实验步骤：将lh14在lb培养基中培养至对数期，5000 rpm下离心7分钟收集菌体并在无菌10mm mgcl2中重悬至od600=1。水稻种子发芽前，用10%次氯酸钠消毒10分钟，然后用无菌水清洗三次。用菌悬液接种表面消毒过的种子作为处理（终浓度od600=0.5），用无菌10mm mgcl2接种表面消毒过的种子作为阴性对照。不同砷浓度处理设置为0、1和6 mg/ l as(iii)。在培养皿中进行萌发实验，每个培养皿25粒种子，每个处理有三个重复，培养7天后测量种子发芽数和芽长度。
54.结果表明，接种砷甲基化功能芽孢杆菌lh14能增加水稻种子发芽数及其芽长（如图8，表1），对水稻发芽生长有促进作用。相比无砷处理的对照组，随着as(iii)浓度的增加，对抑制水稻种子发芽作用更为明显，说明在砷胁迫下接种lh14后，有助于水稻种子在含as(iii)培养液中的种子萌发与生长。同时，进一步测定种子内吸收的总砷以及无机砷占比显示，接种lh14后，可有效降低种子对总砷的吸收，并且吸收的无机砷比例介于50.5-56.3%，远低于未接种处理组的90.4-94.1%。上述结果证明了lh14可协同实现水稻种子的生长，且降低水稻种子吸收总砷，并降低种子内吸收的无机砷的比例。
55.表1 砷甲基化功能芽孢杆菌lh14对不同浓度as(iii)下种子发芽和生长的影响实施例6：砷甲基化功能芽孢杆菌lh14在土壤中促进亚砷盐转化的效果称取100g含亚砷酸的污染土壤于250ml锥形瓶中，每份土样加入100ml超纯水。实验分为3个处理，即土壤对照组(即原始土)，土壤灭菌处理组，土壤+lh14菌组，每个处理有三个平行。菌株在lb培养基中培养一天至对数期，浓缩至od约为5.0，用于接种；菌液接种时，先于5000rpm条件下离心10min后去上清，收集菌体，用新r2a培养基混匀菌体沉淀用于接种。所有处理放置于30℃摇床中200rpm条件下培养7天，培养结束后从培养瓶中分别取出10 ml土悬液，加入草酸提取有效态砷，后经7000rpm高速离心，取上清液过0.22μm滤膜后，用hplc-icp-ms进行砷形态测定。
56.由图9可知，培养7天后，土壤灭菌组，提取液中亚砷酸和砷酸的含量分别为15.1μmol/l和0.5μmol/l，而土壤对照组中，亚砷酸和砷酸的含量分别为12.4μmol/l和1.5μmol/
l，有机砷浓度小于0.005μm；而接种lh14的处理组中，亚砷酸和砷酸浓度分别为6.2μmol/l和2.3μmol/l，甲基砷(即二甲基砷和三甲基砷)含量达到了3.5μmol/l，较对照组和灭菌处理组显著增加。土壤接种lh14实验结果表明，砷甲基化功能芽孢杆菌lh14能在土壤环境下将高毒性无机砷转化为低毒性甲基砷，以及部分氧化为五价砷，在稻田土壤砷污染的修复方面显著出应用前景。
57.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。