一种羊胎盘多肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及一种改进的羊胎盘多肽。


背景技术：

2.羊胎盘是母羊孕育胎儿时负责母体、胎儿血液和养分交换的组织，能够产生较多活性物质，其营养组成与人类胎盘接近。羊胎盘含有丰富的蛋白质、维生素、脂多糖、活性多肽、生长因子、多种氨基酸和微量元素等成分以及与免疫功能和维持机体正常运转相关的抗体等，能够被很好的吸收。据《本草纲目》记载，胎盘又称胞衣或紫河车，味甘、咸、温，入肺、肝、肾三经，有温中益气、养阴补血、美容养颜、防癌、抗衰老、调节内分泌、提高机体免疫力等多种功效，被广泛应用于医疗保健、食品、化妆品等领域。在瑞士羊胎盘提取液已经被添加运用到化妆品的生产中，同时，一些国内研究学者也将羊胎盘抗氧化肽应用到部分抗衰老的化妆品中。由于抗氧化肽具有良好的抗氧化活性、高稳定性、易吸收、安全营养等优点，成为近年来国内外研究的热点。
3.胎盘肽，又称为胎盘免疫活细胞素、胎盘免疫调节肽、胎盘转移因子、胎盘免疫调节因子，胎盘免疫调节肽是目前研究较深入的胎盘提取物，其成分和稳定性与提取时所采取的工艺有关。胎盘免疫调节肽属于小分子物质，是小分子量核苷酸以及肽类物质的混合物，分子量小于5000da，含有多种氨基酸。周国华等报道，胎盘肽为无色或微黄透明液体，含有多种氨基酸，具有可透性，可超滤性，蛋白质反应阴性，无抗原性等多种特性，冻干品通常为白色疏松状粉末，且极易溶于水。
4.酶解法是目前大规模制备生物活性肽的常用方法，通过加入蛋白酶来达到对蛋白质进行适度的水解。酶解法的原理是利用蛋白酶的专一性、高效性、选择性等特点。酶解过程一般都是在相对比较温和的环境中进行，酶解过程虽难以控制，但酶解法也因安全性高、条件温和、成本较低等优势而受到广泛重视。
5.本文以羊胎盘为原料，采用酶解法制备羊胎盘多肽，对其进行蛋白质含量测定、脱腥处理，同时比较不同条件提取羊胎盘肽的抗氧化活性。


技术实现要素：

6.1、要解决的问题
7.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种羊胎盘多肽的制备方法和应用，具体来说：发明目的：比较两种不同蛋白酶提取羊胎盘多肽的得率，同时筛选出最优工艺，并对不同条件下的提取物进行脱腥处理、蛋白质含量测定、抗氧化活性比较；发明方法：采用蛋白酶酶解羊胎盘，酿酒酵母对酶解液进行脱腥处理，通过随机寻找34人对脱腥后的酶解液进行评比打分，然后超滤得到不同分子量的酶解液，用凯氏定氮仪测定蛋白质含量，最后用抗氧化活性测定试剂盒进行测定活性；结论：通过对胃蛋白酶与木瓜蛋白酶进行筛选确定最优的酶解工艺为：木瓜蛋白酶5
‰
，ph 6.40，55℃酶解6小时，10000rpm离心20min。酿酒酵母发酵脱腥最佳条件：酵母液5％，28℃振荡培养箱培养24小时，不同提取条件下的酶
解液均有不同程度的抗氧化活性。
8.2、技术方案
9.为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
10.一种羊胎盘多肽的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)羊胎盘的处理
12.羊胎盘室温解冻，清水冲洗后用75％的乙醇浸泡30min，剪碎，沥干水分，称重后倒入破壁机中，加入生理盐水进行捣碎得到羊胎盘匀浆；
13.(2)酶解法制备羊胎盘多肽
14.将步骤(1)得到的羊胎盘匀浆加入胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，进行处理后置于振荡培养箱进行第一次酶解6h，离心处理后得到的上清液与沉淀部分，其中沉淀部分再次加入胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行第二次酶解4h，离心处理后合并两次上清液进行冷藏，得到酶解液；
15.(3)羊胎盘酶解液的脱腥
16.将步骤(2)得到的酶解液加入酿酒酵母，转移到振荡培养箱培养，即可。
17.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
18.步骤(1)中生理盐水与羊之间的质量比为2：1。
19.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
20.步骤(2)中胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的加入质量百分比为5
‰
。
21.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
22.步骤(2)中离心的参数为10000rpm、2h。
23.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
24.步骤(2)中将步骤(1)得到的羊胎盘匀浆加入胃蛋白酶，同时ph值调整为2.0，进行处理后置于振荡培养箱进行第一次酶解6h、温度为37℃，离心处理后得到的上清液与沉淀部分，其中沉淀部分再次加入胃蛋白酶进行第二次酶解4h、温度为55℃，离心处理后上清液与沉淀部分进行冷藏。
25.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
26.步骤(2)中将步骤(1)得到的羊胎盘匀浆加入木瓜蛋白酶，同时ph值调整为6.4，进行处理后置于振荡培养箱进行第一次酶解6h、温度为37℃，离心处理后得到的上清液与沉淀部分，其中沉淀部分再次加入木瓜蛋白酶进行第二次酶解4h、温度为55℃，离心处理后上清液与沉淀部分进行冷藏。
27.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
28.步骤(3)中酿酒酵母的加入质量百分比为5
‰
。
29.上述所述的羊胎盘多肽的制备方法中，
30.步骤(3)中培养的温度为28℃；
31.步骤(3)中培养的时间为24h。
32.一种如上述所述的制备方法得到的羊胎盘多肽。
33.一种如上述所述的羊胎盘多肽在抗氧化中的应用。
34.3、有益效果
35.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
36.本发明以羊胎盘为原料，采用酶解法制备羊胎盘多肽，以酶解率为指标，确定了在工艺生产中可采用木瓜蛋白酶进行水解，最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶5
‰
、ph 6.40、55℃酶解 6小时、10000rpm离心20min。在此条件下羊胎盘酶解率为95.02％。本文采用酿酒酵母对羊胎盘酶解液的脱腥条件进行筛选，确定其最佳条件为：酵母液5％，28℃振荡培养箱培养2 4小时。脱腥后的酶解液采用超滤离心管进行分离，对三个不同分子量进行蛋白质含量与活性测定，蛋白质含量最高的是分子量3-10kda胃蛋白酶+木瓜蛋白酶37℃的酶解液。活性测定时dpph自由基清除率最好的是分子量3-10kda胃蛋白酶+木瓜蛋白酶37℃的酶解液，且在三个不同分子量的酶解液中，分子量为3-10kda的酶解液dpph自由基清除率最好，抑制与产生超氧阴离子自由基测试效果最好的是木瓜蛋白酶+胃蛋白酶37℃脱腥后原液，羟自由基清除率最高的是分子量3-10kda木瓜蛋白酶+胃蛋白酶37℃的酶解液，总抗氧化能力最好的是分子量《3kda胃蛋白酶+木瓜蛋白酶37℃的酶解液。
附图说明
37.图1为本发明的dpph自由基清除能力标准曲线图；
38.图2为本发明的维生素c标准曲线图；
39.图3为本发明的总抗氧化能力标准曲线图。
具体实施方式
40.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
41.1.实验材料
42.1.1实验原料
43.冷冻羊胎盘(由珠海市华喜生物科技有限公司提供) 1.2药品与试剂
44.如表1所示。
45.表1
46.甲基红天津市科密欧化学试剂有限公司硫酸(分析纯)广东广试试剂科技有限公司硫酸铜(分析纯)天津市大茂化学试剂厂硫酸钾(优级纯)天津市科密欧化学试剂有限公司氯化钠(分析纯)上海麦克林生化科技有限公司木瓜蛋白酶广州利源食品添加剂有限公司硼酸(分析纯)天津市大茂化学试剂厂氢氧化钠天津市大茂化学试剂厂无水乙醇天津市富宇精细化工有限公司胃蛋白酶广州利源食品添加剂有限公司溴甲酚绿天津市科密欧化学试剂有限公司盐酸广州化学试剂厂dpph自由基清除能力试剂盒南京建成生物工程研究所羟自由基测试盒南京建成生物工程研究所抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒南京建成生物工程研究所
总抗氧化能力(t-aoc)测试盒南京建成生物工程研究所
47.1.3实验仪器
48.如表2所示。
49.表2
[0050][0051][0052]
2.实验方法
[0053]
2.1羊胎盘的处理
[0054]
羊胎盘室温解冻，清水冲洗后用75％的乙醇浸泡约30min，剪碎，沥干水分，称重后(m ＝179.677g)倒入破壁机中，加入生理盐水(羊胎盘:生理盐水＝1:2)进行捣碎得到羊胎盘匀浆。
[0055]
2.2酶解法制备羊胎盘多肽
[0056]
羊胎盘匀浆加入胃蛋白酶或木瓜蛋白酶5
‰
，按照以下条件进行处理后置于振荡培养箱进行酶解6小时，10000rpm离心20min处理得到的沉淀部分再次加入木瓜蛋白酶或胃蛋白酶5
‰
进行二次酶解4小时，10000rpm离心20min得到上清液与沉淀保存在层析实验冷柜中，以便进行下一步实验。通过比较酶解率，筛选出最佳的提取工艺，如表3所示。
[0057]
表3酶解条件
[0058]
蛋白酶ph第一次酶解温度(℃)第二次酶解温度(℃)胃蛋白酶2.03755木瓜蛋白酶6.43755
[0059]
2.3酿酒酵母发酵脱腥
[0060]
2.3.1培养基的配制
[0061]
蛋白粉与葡萄糖各2％，配制后于121℃高压灭菌20min，加入酿酒酵母5μl置于28℃振荡培养箱培养备用。
[0062]
2.3.2羊胎盘酶解液的脱腥
[0063]
羊胎盘酶解液加入酿酒酵母5％，28℃振荡培养箱培养，通过随机寻找34人对脱腥处理的酶解液进行评比打分，对比发酵培养0小时；2小时；4小时；8小时；24小时的酶解液的脱腥效果。
[0064]
2.4蛋白质含量测定
[0065]
将脱腥处理后的羊胎盘酶解液进行超滤离心，得到不同分子量的样品，然后利用凯氏定氮仪测定蛋白质含量。
[0066]
2.5抗氧化活性测定
[0067]
2.5.1dpph自由基清除能力测定
[0068]
根据dpph自由基清除能力试剂盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其a517nm吸光度，80％甲醇作空白对照，维生素c乙基醚作阳性对照。
[0069]
dpph自由基清除率(％)＝{1-(a测定-a对照)/a空白}
×
100％
[0070]
2.5.2清除超氧阴离子自由基测试
[0071]
根据抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其a550 nm吸光度，超纯水作空白对照，维生素c乙基醚作阳性对照。
[0072]
清除率(％)＝{(a对照管-a测定管)/a对照管}
×
100％
[0073]
2.5.3羟自由基清除实验
[0074]
根据羟基自由基测定试剂盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其a550 nm吸光度，超纯水作空白对照，维生素c乙基醚作阳性对照。
[0075]
清除率(％)＝{(a对照-a测定)/a对照}
×
100％
[0076]
2.5.4总抗氧化能力测试
[0077]
根据总抗氧化能力测定试剂盒说明书步骤进行操作，于酶标仪测得其a593 nm吸光度，蒸馏水作空白对照，维生素c乙基醚作阳性对照。
[0078]
总抗氧化能力(mmol/g)＝(3.654x-0.4109)
×
蛋白浓度(mg/ml)
[0079]
式中x表示样品于酶标仪测得其a593 nm吸光度。
[0080]
2.6统计分析
[0081]
本文所有试验数据均为三次重复试验，试验结果以平均值加减标准差(x
±
s)来表示，采用软件spss 22.0，采用lsd法对实验结果进行统计分析。
[0082]
结果：
[0083]
1.酶解制备羊胎盘多肽
[0084]
如表4所示，单酶酶解率最高的是木瓜蛋白酶55℃时，酶解率为95.02％，组合酶酶解率最高的是木瓜蛋白酶胃蛋白酶55℃为98.39％，仅木瓜蛋白酶的酶解率就已经高达95.02％了，从经济与酶解率两方面综合考虑，可以仅使用木瓜蛋白酶对羊胎盘进行酶解提取。
[0085]
表4不同蛋白酶的酶解率％(x
±
s，n＝3)
[0086][0087][0088]
注：同列数字右肩不同小写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；胃木37℃：第一次加入胃蛋白酶，第二次加入木瓜蛋白酶37℃进行酶解；胃木55℃：第一次加入胃蛋白酶，第二次加入木瓜蛋白酶55℃进行酶解；木胃37℃：第一次加入木瓜蛋白酶，第二次加入胃蛋白酶37℃进行酶解；木胃55℃：第一次加入木瓜蛋白酶，第二次加入胃蛋白酶55℃进行酶解，下同。
[0089]
2.酿酒酵母发酵脱腥评分
[0090]
由表5可知，从腥味、异味与总体评价三方面的评分来看，不论是哪个样品，都是在发酵24小时的评分最高，说明在酵母液5％，28℃条件下羊胎盘酶解液脱腥效果最佳的时间是 24小时。
[0091]
表5脱腥评分实验结果(x
±
s，n＝3)
[0092][0093]
注：同列数字右肩不同小写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；同行数字右肩不同大写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；1号:胃木37℃2号:胃木55℃3号:木胃37℃4号: 木胃55℃；分值为1-9分，1-3分，难以接受；4-6分，尚可接受；7-9分，完全接受，分值越高说明脱腥效果越好。
[0094]
3.凯氏定氮仪测定蛋白质含量
[0095]
由表6、表7及表8可知，超滤处理后不同分子量的三部分样品百分比之和并不是100％，可能的原因是在超滤过程中有部分样品粘到了滤膜上从而造成了小量的损失。
[0096]
表6不同分子量样品的体积百分比
[0097]
样品名称《3kda(％)3-10kda(％)》10kda(％)胃
→
木37℃62.4532.654.50
胃
→
木55℃43.4728.5721.02木
→
胃37℃49.8037.556.73木
→
胃55℃61.2324.908.16
[0098]
表7蛋白质含量
[0099][0100]
表8脱腥前后蛋白质质量
[0101]
样品名称样品名浓度(mg/ml)质量(mg)胃
→
木37℃未脱腥原液1.726784.6067胃
→
木55℃ 4.8657238.4177木
→
胃37℃ 2.7600135.2400木
→
胃55℃ 4.2440207.9560胃
→
木37℃脱腥后原液1.130355.3863胃
→
木55℃ 1.753385.9133木
→
胃37℃ 1.189758.2937木
→
胃55℃ 3.4440168.7560
[0102]
4.抗氧化活性测定
[0103]
4.1dpph自由基清除能力测定
[0104]
如表9和图1所示，胃蛋白酶木瓜蛋白酶37℃分子量3-10kda与未脱腥原液的清除率最高，分别是42.95％和42.20％，其他提取条件的酶解液也有dpph自由基清除能力，基本在30％左右。相同蛋白酶比较未脱腥原液的清除率均高于脱腥后原液；分子量3-10kda的清除率大于另外两组分子量，说明温度，脱腥处理、分子量的不同都可能对dpph自由基清除能力有影响。
[0105]
表9羊胎盘多肽酶解液dpph自由基清除率％(n＝3)
[0106][0107]
[0108]
注：同列数字右肩不同小写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；同行数字右肩不同大写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)。
[0109]
4.2清除超氧阴离子自由基测试
[0110]
如表10和图2所示，清除超氧阴离子能力测定清除率最好的是木瓜蛋白酶
→
胃蛋白酶，在37℃酶解条件下的脱腥后原液为20.34％。脱腥后原液的清除率大于未脱腥原液，说明脱腥处理对抗氧化活性可能有影响。
[0111]
表10羊胎盘多肽酶解液清除超氧阴离子自由基清除率％(n＝3)
[0112] 胃
→
木37℃胃
→
木55℃木
→
胃37℃木
→
胃55℃《3kda-2.28
±
0.05
bb
16.97
±
2.22
aa-33.29
±
3.91
cb-0.64
±
4.18
abc
3-10kda3.01
±
2.09
ba
8.35
±
1.31
ba-2.32
±
7.73
ba
3.97
±
2.81
aa
》10kda1.51
±
2.28
ba-13.64
±
3.19
dc-7.87
±
5.26
bb-3.65
±
3.52
aab
未脱腥原液4.67
±
6.58
ba-3.13
±
0.18
ca-6.34
±
2.51
ba
6.73
±
9.46
aa
脱腥后原液13.25
±
4.85
aa
13.23
±
2.47
aa
20.34
±
7.85
aa
11.25
±
10.25
aa
[0113]
注：同列数字右肩不同小写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；同行数字右肩不同大写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)。
[0114]
4.3羟自由基清除实验
[0115]
由表11可以看出来，未脱腥原液除了木瓜蛋白酶胃蛋白酶55℃这一条件的酶解液具有清除率，且仅有6.66％。脱腥后原液清除率均高于未脱腥原液，说明脱腥处理不但不会降低样品的抑制率，可能还会使其清除率增加。
[0116]
表11羊胎盘多肽酶解液羟自由基清除率％(n＝3)
[0117] 胃
→
木37℃胃
→
木55℃木
→
胃37℃木
→
胃55℃《3kda66.18
±
2.44
aca
62.78
±
0.60
ba
58.55
±
1.19
cb
37.02
±
2.38
bc
3-10kda65.92
±
2.61
ada
61.09
±
2.96
bb
72.60
±
0.68
ab
47.45
±
3.53
ac
》10kda56.14
±
1.80
bc
69.00
±
1.44
aa
64.51
±
1.48
bb
35.96
±
3.78
bd
未脱腥原液-30.31
±
1.26
ea-32.67
±
5.38
cb-30.54
±
6.91
db
6.66
±
3.74
cb
脱腥后原液67.70
±
2.38
aa
59.46
±
1.80
bb
60.58
±
0.53
bcb
43.46
±
0.82
ac
[0118]
注：同列数字右肩不同小写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；同行数字右肩不同大写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)。
[0119]
4.4总抗氧化能力测试
[0120]
如表12所示，胃蛋白酶
→
木瓜蛋白酶37℃分子量《3kda的总抗氧化能力最好，脱腥前后样品总抗氧化能力相差不大，说明脱腥处理对总抗氧化能力影响较小。
[0121]
表12羊胎盘多肽酶解液总抗氧化能力mmol/g(n＝3)
[0122] 胃
→
木37℃胃
→
木55℃木
→
胃37℃木
→
胃55℃《3kda0.16
±
0.01
aa
0.13
±
0.01
aa
0.12
±
0.01
aa
0.14
±
0.02
ab
3-10kda0.11
±
0.01
ca
0.10
±
0.01
ba
0.12
±
0.03
aa
0.13
±
0.02
aa
》10kda0.11
±
0.00
bc
0.10
±
0.01
bb
0.10
±
0.01
ab
0.12
±
0.01
aba
未脱腥原液0.11
±
0.00
ca
0.08
±
0.01
bc
0.09
±
0.01
ab
0.09
±
0.01
bb
脱腥后原液0.11
±
0.01
ba
0.07
±
0.00
cb
0.11
±
0.02
ab
0.10
±
0.01
ba
[0123]
注：同列数字右肩不同小写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)；同行数字右肩不同大写字母代表显著差异(p《0.05)，含相同字母代表无显著差异(p》0.05)。
[0124]
讨论：
[0125]
本发明以羊胎盘为原料，采用酶解法制备羊胎盘多肽，以酶解率为指标，确定了在工艺生产中可采用木瓜蛋白酶进行水解，最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶5
‰
、ph 6.40、55℃酶解 6小时、10000rpm离心20min。在此条件下羊胎盘酶解率为95.02％。本文采用酿酒酵母对羊胎盘酶解液的脱腥条件进行筛选，确定其最佳条件为：酵母液5％，28℃振荡培养箱培养2 4小时。脱腥后的酶解液采用超滤离心管进行分离，对三个不同分子量进行蛋白质含量与活性测定，蛋白质含量最高的是分子量3-10kda胃蛋白酶+木瓜蛋白酶37℃的酶解液。活性测定时dpph自由基清除率最好的是分子量3-10kda胃蛋白酶+木瓜蛋白酶37℃的酶解液，且在三个不同分子量的酶解液中，分子量为3-10kda的酶解液dpph自由基清除率最好，抑制与产生超氧阴离子自由基测试效果最好的是木瓜蛋白酶+胃蛋白酶37℃脱腥后原液，羟自由基清除率最高的是分子量3-10kda木瓜蛋白酶+胃蛋白酶37℃的酶解液，总抗氧化能力最好的是分子量《3kda胃蛋白酶+木瓜蛋白酶37℃的酶解液。本实验超滤得到的样品为微黄色透明液体，可能的原因有：提取方法与条件的不同，羊的种类、羊胎盘的胎次等，真实的原因还有待继续研究。
[0126]
羊胎盘开发利用成本利用率都极低，造成了很大程度上的资源浪费以及环境污染，但其来源广泛，生物活性物质丰富，食用和药用价值极高，同时羊和人的胎盘在营养成分与功效上也具有较大相似度，相对而言安全有保障，因此对胎盘活性物质的进一步硏究，改进目前加工技术，充分利用其有效成分，提高活性物质的稳定性，使产品有利于质量控制与工业化生产是不可忽视的问题。
[0127]
结论：酶解法提取羊胎盘多肽的最优工艺条件：木瓜蛋白酶5
‰
，ph 6.40，55℃酶解6 小时，羊胎盘多肽的酶解率为95.02％。酿酒酵母脱腥处理的最佳条件：酵母液5％，28℃振荡培养箱培养24小时。通过对比不同提取条件的酶解液均有不同程度的抗氧化活性。
[0128]
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。