一种融合型腺相关病毒及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，涉及一种融合型腺相关病毒及其应用，尤其涉及在耳病和/或眼科疾病的预防和/或治疗中的应用。

背景技术：

1、迄今为止已知的人类疾病约有七千多种，其中基因问题导致的疾病占了80％左右，世界上有三亿多人深受基因类疾病的困扰。目前的化学疗法、蛋白质疗法等仅能治疗不到500种人类疾病，对基因问题导致的疾病通常是无力的，所以需要开发新的药物和治疗方案。

2、基因治疗是一种新兴的治疗方法，它可以将功能基因输送到患者体内，以对抗或替代功能失调的基因，从而在没有化学药物干预、放射治疗或手术的情况下治愈疾病。基因疗法通过病毒或非病毒载体将遗传物质引入靶细胞，通过纠正或补充缺陷基因来治疗或预防疾病，治疗的效果可以是持久的，不需要重复干预。基因治疗可以通过离体或体内策略来实现，离体基因疗法是从患者身上采集靶细胞，经过基因改造并回输到患者体内；体内基因疗法是将遗传物质直接递送到患者的靶器官或组织中。目前已经利用各种类型的基因递送策略对癌症、失明、免疫和神经元疾病等多种疾病进行了治疗。

3、病毒载体是最常用的基因治疗递送载体，因为它进入细胞和引入遗传物质的效率很高，常用的有腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒(aav)等。如今，aav载体在体内基因治疗的临床试验中取得了很好的效果，逆转录病毒和慢病毒载体是体外基因治疗临床试验中的首选载体。aav能够成功作为治疗性基因递送载体的主要因素是其低免疫原性和缺乏致病性。多项上市药物批准和正在进行的临床试验，证明了aav载体已成为基因治疗的主要基因递送工具之一。2012年，glybera是欧洲第一个获批用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症的aav疗法。这些药物的上市清楚地证明了基于aav的治疗方法的安全性和有效性。此后，用于治疗leber先天性黑蒙的luxturna和用于治疗脊髓性肌萎缩症(sma)的zolgensma分别于2017年和2019年获得美国食品药品监督管理局(fda)的批准。目前的临床研究集中在通过基因替代、基因沉默或基因编辑治疗单基因疾病。aav除可用于癌症、失明、免疫和神经元疾病等多种疾病的治疗外，还有望用于疫苗的开发。

4、虽然aav具有低免疫原性和低致病性的特点，基于aav的基因疗法也取得了惊人的成功，但由于人体免疫系统预先存在天然aav衣壳蛋白的中和抗体，目前多达50％的患者被排除在这种治疗方法之外。为规避这种免疫障碍，可以用工程改造的aav衣壳逃避预先存在的中和抗体或采取治疗前暂时清除中和抗体的方法。工程改造aav衣壳不仅可以逃避中和抗体，还可以使aav靶向到预期的组织细胞类型，实现精准治疗的目的。定向进化是当前改造aav衣壳的强大工具，从原理上讲，定向进化采用高通量技术手段将突变引入基因及其编码的蛋白质中，并模拟自然进化极大的加速蛋白多样化和选择过程。该方法包括三个基本步骤：建立目标基因的序列多样化文库，从突变基因库编码的蛋白质库中进行筛选以及扩增编码所需性状的基因序列。这三个步骤构成了一轮定向进化，可以迭代进行多轮进化筛选，直到获得具有改良特性的特异基因/蛋白质。

5、但是，目前将腺相关病毒用作听力系统基因治疗的载体，仍然存在组织特异性较差，感染效率不高等缺点，例如已知腺相关病毒载体在感染毛细胞的同时，也会感染支持细胞；而支持细胞和毛细胞会分别表达不同的致病基因，这种载体感染的非特异性对于疾病的治疗存在不利影响。因此，要实现精准基因治疗，需要高效且特异的新型重组腺相关病毒载体。

技术实现思路

1、本发明的目的旨在克服现有技术的缺陷，提出改造一种新兴的可以在耳蜗、眼睛视网膜等组织高效特异递送基因的新型腺相关病毒载体，用于基因治疗。本发明将改造的新型腺相关病毒载体在体感染小鼠耳蜗，能够介导目的基因特异性地在耳蜗支持细胞中表达，从而特异标记或操控支持细胞。该新型腺相关病毒在耳蜗支持细胞的结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗等方面具有广泛的应用价值和市场前景。同时，将该病毒通过玻璃体注射到小鼠眼球中发现，该病毒载体具有较目前现有载体更优异的感染特性，在眼科细胞的结构与功能解析、疾病模型建立和基因治疗等方面同样具有广泛的应用价值和市场前景。

2、本发明的目的之一是提供一种融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含血清型aav1、2、6和7的肽段的融合肽段或其变体。

3、本发明的另一目的是提供一种核酸，所述核酸编码如上所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白。

4、本发明的另一目的是提供一种构建体，所述构建体含有如上所述的核酸。

5、本发明的另一目的是提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的构建体或基因组中整合有外源的如上所述的核酸，或所述宿主细胞包含如上所述的融合型腺相关病毒aav-wm01。

6、本发明的另一目的是提供一种融合型腺相关病毒aav-wm01，所述融合型腺相关病毒的衣壳结构含有如上任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白。

7、使用如上所述的融合型腺相关病毒转化的宿主细胞。

8、本发明的另一目的是提供一种融合型腺相关病毒载体系统，包含包装质粒，所述包装质粒中包含如上所述的核酸或核酸片段。

9、本发明的另一目的是提供一种融合型腺相关病毒，由如上所述融合型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。

10、本发明的另一目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上任一项所述的融合型腺相关病毒以及药学上可接受的辅料。

11、本发明的另一目的是提供如上所述融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白、核酸、构建体、融合型腺相关病毒、宿主细胞、融合型腺相关病毒载体系统、药物组合物或偶联物在制备治疗疾病的药物中的用途；优选地，在制备基因治疗疾病的药物中的用途。

12、与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：(1)提供了一种支持细胞特异性新型腺相关病毒载体aav-wm01，能够介导目的基因特异性地在新生小鼠耳蜗支持细胞中表达；(2)提供了一种新型腺相关病毒载体aav-wm01，能够介导目的基因特异性地在成年小鼠耳蜗内毛细胞中表达；(3)提供了一种新型腺相关病毒载体aav-wm01，能够介导目的基因特异性地在成年小鼠视网膜rpe层中表达；(4)新型腺相关病毒载体aav-wm01介导目的基因表达比传统的转基因方法更灵活，安全性更高，应用更方便，成本更低；(5)新型特异性的腺相关病毒载体aav-wm01使得开发精准治疗耳科及眼科相关疾病的基因疗法成为可能。

技术特征：

1.一种融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白，其特征在于，所述衣壳蛋白包含血清型aav1、2、6和7的肽段的融合肽段或其变体。

2.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白，其特征在于，所述融合肽段包含依次连接的第一肽段、第二肽段、第三肽段、第四肽段和第五肽段；所述第一肽段包含来自aav1的肽段，所述第二肽段包含来自aav7的肽段，所述第三肽段包含来自aav2的肽段，所述第四肽段来自包含aav1的肽段，所述第五肽段来自包含aav6的肽段。

3.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白，其特征在于，所述第一肽段包含seq id no.3所示的氨基酸片段，所述第二肽段包含seq id no.4所示的氨基酸片段，所述第三肽段包含seq id no.5所示的氨基酸片段，所述第四肽段包含seq id no.6所示的氨基酸片段，所述第五肽段包含seq id no.7所示的氨基酸片段。

4.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白，其特征在于，包括以下至少任一项：

5.如权利要求1所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白，其特征在于，所述衣壳蛋白包括：

6.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1～5任一权利要求所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白。

7.一种构建体，所述构建体含有如权利要求6所述的核酸。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求7所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求6所述的核酸，或所述宿主细胞包含如权利要求1～5任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm01。

9.一种融合型腺相关病毒aav-wm01，其特征在于，所述融合型腺相关病毒aav-wm01的衣壳结构含有如权利要求1～5任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白。

10.如权利要求9所述的融合型腺相关病毒aav-wm01，其特征在于，所述融合型腺相关病毒还包括编码目的产物的异源核苷酸序列；优选地，所述目的产物为核酸或者蛋白质；进一步地，所述核酸包括但不限于小向导rna、干扰rna。

11.使用如权利要求9或10所述的融合型腺相关病毒aav-wm01转化的宿主细胞。

12.一种融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，包含包装质粒，所述包装质粒中包含权利要求6所述的核酸。

13.如权利要求12所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述包装质粒中还包含腺相关病毒的rep基因片段。

14.根据权利要求12所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括表达质粒，所述表达质粒包含负责编码目的产物的异源核苷酸；优选地，所述目的产物为核酸或者蛋白质；进一步地，所述核酸包括但不限于小向导rna、干扰rna。

15.根据权利要求12-14任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统，其特征在于，所述腺相关病毒载体系统还包括辅助病毒质粒或辅助病毒，所述腺相关病毒载体系统还包括宿主细胞。

16.一种融合型腺相关病毒aav-wm01，由权利要求12-15任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统经病毒包装获得。

17.一种药物组合物或偶联物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求9、10或16任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm01以及药学上可接受的辅料；所述偶联物包含如权利要求9、10或16任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm01以及其上连接的生物活性多肽。

18.如权利要求1～5任一项所述的融合型腺相关病毒aav-wm01衣壳蛋白、或如权利要求6所述的核酸、或如权利要求6所述的构建体、如权利要求9、10或16所述的融合型腺相关病毒aav-wm01或如权利要求8或11所述的宿主细胞、权利要求12-15任一项所述的融合型腺相关病毒载体系统、或如权利要求17所述的药物组合物或偶联物在制备治疗疾病的药物中的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，包括以下至少一项：

20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，包括以下至少一项：

技术总结
本发明涉及生物医药领域，公开了一种融合型腺相关病毒及其在耳病和眼科疾病中的应用。所述融合型腺相关病毒包含血清型AAV1、2、6和7的肽段融合形成的融合肽段或其变体，其能高效地转导耳蜗中的毛细胞和/或支持细胞，促进内毛细胞再生，帮助恢复听力，所述腺相关病毒也能高效地感染RPE层，用于眼科疾病治疗。所述融合型腺相关病毒作为安全的载体，在治疗耳病或眼科疾病中具有广泛应用前景。

技术研发人员：钟桂生,储岑凤
受保护的技术使用者：合肥星眸生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15