一种人源外胚间充质干细胞分泌组及其冻干粉的制备方法和应用

本发明属于干细胞与再生医学，尤其涉及一种人源外胚间充质干细胞分泌组及其冻干粉的制备方法和应用。

背景技术：

1、脑白质是由少突胶质细胞构成的髓鞘包覆神经元轴突组成，主要功能是传导不同灰质区域的信号。脑白质本身具有缺血易损性，轻度缺血即可造成损伤。临床上发现中枢神经系统的很多疾病都存在脑白质损伤，从新生儿因缺血缺氧造成的脑室周围白质软化、成年期的卒中到老年期的血管性痴呆，脑白质都是缺血缺氧损伤的一个靶点。值得注意的是，即使是正常的老年人，也被发现存在大量的脑白质损伤。

2、少突胶质细胞(oligodendrocytes，ols)根据其分化过程中的形态、增殖、迁移及髓鞘形成的特性，可分为少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor/precursorcells，opcs)、髓鞘化前少突胶质细胞(pre-myelinating oligodendrocytes，pre-ols)及髓鞘化少突胶质细胞(myelinating oligodendrocytes)。研究显示，中枢神经系统白质髓鞘化障碍是脑白质损伤的主要表现，而损伤后opcs发育停滞在pre-ols阶段，不能进一步分化为成熟ols是造成髓鞘化不足的主要原因。

3、间充质干细胞(mscs)移植用于治疗各种神经疾病已经被广泛研究，其强大的旁分泌功能已被证实是发挥治疗作用的主要途径。msc分泌组即msc所分泌的生物活性分子的总和，包括细胞因子、趋化因子和生长因子等多种活性成分，对损伤组织的修复、再生及功能恢复等许多生理过程具有调控作用。在创伤治疗领域，基于msc分泌组研制的制剂极有可能成为替代msc移植治疗的新疗法。然而，目前并没有一种可应用于工厂化生产的msc分泌组的制备方法。

4、因此，如何提供一种产率高、活性好、生产成本低的msc分泌组及其制备方法，已成为亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种人源外胚间充质干细胞分泌组及其冻干粉的制备方法和应用，通过对人源外胚间充质干细胞分泌组及其冻干粉的制备方法进行优化，并制定相应的质量标准，为人源外胚间充质干细胞分泌组的标准化、工厂化生产创造了条件，相应的产品在缺血缺氧性脑病中的白质损伤的治疗中具有重要的应用价值。

2、为达此目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种人源神经嵴细胞(ncscs)培养基，所述人源神经嵴细胞培养基包括：1.5％～3％牛血清白蛋白(m/v)、青霉素/链霉素双抗溶液、l-丙氨酰-l-谷氨酰胺溶液、非必要氨基酸溶液、微量元素a溶液、微量元素b溶液、微量元素c溶液、2-巯基乙醇溶液、8～15μg/ml运铁蛋白、40～60μg/ml l-抗坏血酸钠、5～20ng/ml人表皮生长因子受体调节蛋白β-1、180～250ng/ml人长r3胰岛素样生长因子、5～10ng/ml碱性纤维母细胞生长因子、2～4μm选择性糖原合酶激酶3抑制剂和10～30μm选择性转化生长因子β的i型受体活化素受体样激酶抑制剂。

4、本发明中，通过对培养基组分进行优化，提高了人源全能干细胞向人源神经嵴细胞的分化效率，使最终分化得到的间充质干细胞具有良好的生物活性，为人源外胚间充质干细胞分泌组及其冻干粉的制备创造了良好的条件。

5、其中，所述牛血清白蛋白(probumin)在所述人源神经嵴细胞培养基中的质量分数为1.5％～3％，例如可以是1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％或3％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

6、本发明中，所述青霉素/链霉素双抗(penicillin-streptomycin)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.5％～2％，例如可以是0.5％、1％、1.5％或2％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述青霉素/链霉素双抗溶液为购自gibco的商品化产品(货号为15140122)，以100×浓贮溶液的形式存在，在配置培养基时直接加入相应体积分数的浓贮溶液。

7、本发明中，所述l-丙氨酰-l-谷氨酰胺(l-alanyl-l-glutamine)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.5％～3％，例如可以是0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述l-丙氨酰-l-谷氨酰胺溶液为商品化产品，浓度为200mm，在配置培养基时直接加入相应体积分数的溶液。

8、本发明中，所述非必要氨基酸(mem non-essential amino acids)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.5％～1.5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述非必要氨基酸溶液为购自gibco的商品化产品(货号为11140050)，以100×浓贮溶液的形式存在，在配置培养基时直接加入相应体积分数的浓贮溶液。

9、本发明中，所述微量元素a(trace elements a)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.1％～0.5％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述微量元素a溶液为购自corning的商品化产品，以1000×浓贮溶液的形式存在，在配置培养基时直接加入相应体积分数的浓贮溶液。

10、本发明中，所述微量元素b(trace elements b)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.1％～0.5％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述微量元素b溶液为购自corning的商品化产品，以1000×浓贮溶液的形式存在，在配置培养基时直接加入相应体积分数的浓贮溶液。

11、本发明中，所述微量元素c(trace elements c)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.1％～0.5％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述微量元素c溶液为购自corning的商品化产品，以1000×浓贮溶液的形式存在，在配置培养基时直接加入相应体积分数的浓贮溶液。

12、本发明中，所述微量元素a、微量元素b和微量元素c均为corning公司的商品化产品，货号依次为25-021-ci、25-022-ci和25-023-ci。

13、本发明中，所述2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)溶液可根据实际培养情况进行具体限定，例如其在所述人源神经嵴细胞培养基中的体积分数可以为0.1％～0.3％，例如可以是0.1％、0.2％或0.3％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。其中，所述2-巯基乙醇溶液为商品化产品，浓度为55mm，在配置培养基时直接加入相应体积分数的溶液。

14、所述运铁蛋白(transferrin)在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为8～15μg/ml，例如可以是8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml或15μg/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

15、所述l-抗坏血酸钠((+)-sodium l-ascorbate)在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为40～60μg/ml，例如可以是40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、55μg/ml或60μg/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

16、所述人表皮生长因子受体调节蛋白β-1(heregulinβ-1)在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为5～20ng/ml，例如可以是5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml或20ng/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

17、所述人长r3胰岛素样生长因子(longr3 igf-i)在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为180～250ng/ml，例如可以是180ng/ml、190ng/ml、200ng/ml、210ng/ml、220ng/ml、230ng/ml、240ng/ml或250ng/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

18、所述碱性纤维母细胞生长因子(fgf2)在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为5～10ng/ml，例如可以是5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml或10μg/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

19、所述选择性糖原合酶激酶3抑制剂(gsk3 inhibitor ix(bio))在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为2～4μm，例如可以是2μm、2.5μm、3μm、3.5μm或4μm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

20、所述选择性转化生长因子β的i型受体活化素受体样激酶抑制剂(sb431542)在所述人源神经嵴细胞培养基中的浓度为10～30μm，例如可以是10μm、12μm、14μm、16μm、18μm、20μm、22μm、24μm、26μm、28μm或30μm等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

21、第二方面，本发明提供了第一方面所述的人源神经嵴细胞培养基在培养外胚间充质干细胞中的应用。

22、第三方面，本发明提供了一种外胚间充质干细胞的培养方法，所述培养方法包括：

23、对干细胞进行传代培养，再使用第一方面所述的人源神经嵴细胞培养基诱导干细胞进行神经嵴分化后，进行检测；

24、使用间充质干细胞培养基进行传代培养，验证间充质干细胞表型后，得到所述外胚间充质干细胞。

25、优选地，所述干细胞包括人胚胎干细胞或ips细胞。

26、本发明中，选择人源性全能干细胞用于制备外胚间充质干细胞，来源充足，分化效率和均质性高，并具有神经源性等特质，在神经修复方面具有极大的优势。

27、优选地，所述人源神经嵴细胞培养基诱导干细胞的时间为14～20天，例如可以是14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

28、优选地，所述检测包括流式细胞仪检测，所述流式细胞仪检测的标准为神经嵴干细胞的标记物p75和hnk1的阳性率不低于95％，例如可以是95％、96％、97％或98％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

29、优选地，所述间充质干细胞培养基包括：含有8％～15％fbs的deme培养基，其中，fbs的体积分数例如可以是8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

30、作为优选技术方案，本发明所述的外胚间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：

31、(1)使用stempro培养基对人胚胎干细胞或ips细胞进行贴壁培养，保持其未分化状态；

32、(2)使用accutase消化细胞，并按1:(8～12)的比例传代培养；

33、(3)进行神经嵴分化时，以(1～8)×104个细胞/cm2的密度接种于涂布板；

34、(4)待细胞贴壁后，将培养基更换为第一方面所述的人源神经嵴细胞培养基继续培养；

35、(5)每隔4～5天使用accutase消化细胞，并按1:(3～8)的比例传代培养；

36、(6)使用所述人源神经嵴细胞培养基诱导14～20天后，通过流式细胞仪进行检测，神经嵴干细胞的标记物p75和hnk1的阳性率不低于95％；

37、(7)体外培养2～3代后，用accutase消化得到的人源神经嵴细胞，以(1～8)×104个细胞/cm2的密度接种于无涂层组织培养皿，并改用间充质干细胞培养基(含有8％～15％fbs的deme培养基)进行传代培养；

38、(8)6～7天后用胰蛋白酶-edta消化细胞，并按1:(3～4)的比例传代培养，并继续培养至少2代，经流式细胞仪验证间充质细胞表型后，得到所述外胚间充质干细胞。

39、第四方面，本发明提供一种人源外胚间充质干细胞，所述人源外胚间充质干细胞通过第三方面所述的外胚间充质干细胞的培养方法培养得到。

40、第五方面，本发明提供一种人源外胚间充质干细胞分泌组的制备方法，所述制备方法包括：

41、将第四方面所述的人源外胚间充质干细胞置于无血清培养基中培养，培养基离心后收集上清液，得到所述人源外胚间充质干细胞分泌组。

42、本发明中，用于制备干细胞分泌组的种子细胞为人源外胚间充质干细胞，其来源于神经嵴(neural crest，nc)细胞。神经嵴起源于外胚层，通过一系列严格的分子调控信号，可产生终末分化的nc组织，包括交感神经和交感神经节、肾上腺髓质、各种结缔组织和许多其它细胞类型。nc的特点是虽然来源于外胚层，却可以产生各种各样的中胚层细胞。因此，外胚间充质干细胞同时具有间充质干细胞和神经细胞的生物特性，在治疗神经系统性疾病中效果更好。另外，其来源充足，增殖力强，均质性高，在神经系统疾病的治疗中拥有独特的优势。

43、优选地，所述培养的时间为不少于48h，例如可以是48h、50h、52h、54h、56h、58h或60h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

44、优选地，所述离心的条件为2500～3000rpm离心5～20min，其中，离心的速度例如可以是2500rpm、2600rpm、2700rpm、2800rpm、2900rpm或3000rpm等，离心的时间例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

45、第六方面，本发明提供一种人源外胚间充质干细胞分泌组，所述人源外胚间充质干细胞分泌组通过第五方面所述的人源外胚间充质干细胞分泌组的制备方法制备得到。

46、优选地，所述人源外胚间充质干细胞分泌组的质量标准为：1ml人源外胚间充质干细胞分泌组中，pdgf-aa不低于2000pg(例如可以是2000pg、2100pg、2200pg、2300pg、2400pg或2500pg等)、β-ngf不低于50pg(例如可以是50pg、60pg、70pg、80pg、90pg或100pg等)、ccl5不低于200pg(例如可以是200pg、210pg、220pg、230pg、240pg或250pg等)以及tgf-β2不低于1500pg(例如可以是1500pg、1600pg、1700pg、1800pg、1900pg或2000pg等)，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

47、第七方面，本发明提供一种人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉的制备方法，所述制备方法包括：

48、将第六方面所述的人源外胚间充质干细胞分泌组进行透析，收集膜内截留液后进行冷冻干燥，得到所述人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉。

49、优选地，所述透析使用的透析膜的孔径不大于1kd，例如可以是0.5kd、0.6kd、0.7kd、0.8kd、0.9kd或1kd等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

50、优选地，所述冷冻干燥的条件包括：在23～28pa、-55～-45℃下，冷冻干燥45～50h，其中，压强例如可以是23pa、24pa、25pa、26pa、27pa或28pa等，温度例如可以是-45℃、-46℃、-47℃、-48℃、-49℃、-50℃、-51℃、-52℃、-53℃、-54℃或-55℃等，冷冻干燥的时间例如可以是45h、46h、47h、48h、49h或50h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

51、第八方面，本发明提供一种人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉，所述人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉通过第七方面所述的人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉的制备方法制备得到。

52、优选地，所述人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉的质量标准为：总蛋白含量不少于150μg/mg，例如可以是150μg/mg、160μg/mg、170μg/mg、180μg/mg、190μg/mg或200μg/mg等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

53、第九方面，本发明提供第六方面所述的人源外胚间充质干细胞分泌组和/或第八方面所述的人源外胚间充质干细胞分泌组冻干粉在制备疾病预防药物和/或疾病治疗药物中的应用。

54、优选地，所述疾病治疗药物包括促进大脑白质损伤修复药物、促进内源性少突胶质细胞增殖药物、促进内源性少突胶质细胞分化药物、促进中枢神经系统白质髓鞘化药物或促进损伤大脑神经功能恢复药物中的任意一种或至少两种的组合。

55、相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

56、本发明通过人源神经嵴细胞培养基以及培养方法的相互配合，将人源性全能干细胞诱导分化为外胚间充质干细胞；培养所述外胚间充质干细胞得到的人源外胚间充质干细胞分泌组可以促进少突胶质细胞的分化从而促进髓鞘的形成，保护大脑胼胝体区白质结构的完整，促进中枢神经系统白质髓鞘化，显著改善了新生大鼠缺血缺氧模型的神经功能障碍；人全能干细胞来源的外胚间充质干细胞分泌组对脑白质损伤有治疗作用，并有效促进大脑功能的恢复。本发明还建立了人全能干细胞来源的外胚间充质干细胞分泌组及其冻干粉的制备方法，以及可用于鉴定分泌组生物活性的质量指标，为人源外胚间充质干细胞分泌组的标准化、工厂化生产创造了条件，同时促进了相关药物的推广与使用。