一种从大花独蒜兰中提取纯化的联苄类化合物及用途的制作方法

1.本发明涉及一种从大花独蒜兰中提取纯化的联苄类化合物及用途，属于天然产物提取技术领域。


背景技术：

2.大花独蒜兰(pleione barbarae)隶属于兰科(orchidaceae)独蒜兰属(pleione d.don)，原产于我国云南省，为我国特有种，资源丰富。联苄类化合物是独蒜兰属植物的特征化学成分之一，目前，独蒜兰属植物的化学成分研究报道主要集中在《中国药典》收录的两个药用种独蒜兰(p.bulbocodioides)和云南独蒜兰(p.yunnanensis)，而其他种的化学成分研究较少，作为原产于我国的植物种质资源，有较好的研究与应用前景。
3.氧化应激是指机体或细胞内氧自由基的产生与清除失衡，导致活性氧(ros)和活性氮(rns)在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。氧化应激现象在动植物损伤应激及组织衰老过程中普遍存在，抗氧化剂在医疗、美容、植物保护及食品保鲜等诸多领域有广泛应用。植物源抗氧化剂具有稳定性好、无毒无害、资源可再生等优点，广泛推广应用。在抗氧化药物的研发中，1,1-二苯基-2-苦基肼(dpph)自由基清除试验是最常用的抗氧化的测试模型，维生素c是最稳定且常用的阳性对照药。


技术实现要素：

4.本发明提供一种从大花独蒜兰中提取纯化的联苄类化合物，包括化合物1和化合物2，其中化合物1为大花独蒜兰甲素，5,3'-二羟基-2-(3,4-二羟基苄基)-3-甲氧基-联苄，化合物2为大花独蒜兰乙素，5,3'-二羟基-2-(p-羟基苄基)-4'-甲氧基-联苄。
5.一种从大花独蒜兰中提取纯化的联苄类化合物的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)将新鲜大花独蒜兰假鳞茎切碎于烘箱中烘干至恒重，粉碎后过40目筛，得干燥粉末备用；取所得粉末，按照7l/kg比例加入75％乙醇溶液，煮沸后回流提取2h，滤出残渣，保留提取液；
7.(2)步骤(1)所得残渣重复回流提取，将两次提取液合并后减压旋转蒸发浓缩，得提取物a；
8.(3)取提取物a的浸膏用适量纯水溶解后经大孔吸附树脂d101，乙醇与水作为洗脱剂进行梯度洗脱，得到4个馏分dh-1、dh-2、dh-3、dh-4；
9.(4)经硅胶薄层色谱分析，选取dh-3馏分经硅胶柱色谱，二氯甲烷与甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱后，分离纯化得到7个馏分dh-3.1～dh-3.7；其中dh-3.3再经prp512a大孔吸附树脂，用乙醇-水系统进行洗脱，得到10个馏分dh-3.3.1～dh-3.3.10；
10.(5)取dh-3.3.3馏分经sephadex lh-20柱色谱，用甲醇进行洗脱，可得到7个组分dh-3.3.3.1～dh-3.3.3.7，再使用hplc高效液相色谱仪进一步分离纯化dh-3.3.3.3，即可得到化合物1和化合物2。
11.优选的，步骤(1)中烘干温度为50-60℃。
12.优选的，步骤(3)中乙醇：水的比例为0：100～90：10。
13.优选的，步骤(4)中二氯甲烷：甲醇的比例为20：1～1：1，乙醇：水的比例为10：90～100：0。
14.优选的，所述制备方法制得的联苄类化合物在制备抗氧化活性药物中的应用。
15.本发明一种从大花独蒜兰中提取纯化的联苄类化合物，通过体外抗氧化活性试验表明大花独蒜兰联苄类化合物对dpph自由基有显著的清除能力，与阳性对照药维生素c相当，表现出良好的抗氧化活性。
附图说明
16.图1为本发明中化合物1和化合物2的结构式。
具体实施方式
17.下面结合说明书附图对本发明的实施方式进行描述。
18.取50kg大花独蒜兰的新鲜假鳞茎切碎，于烘箱中50℃干燥18h，将干燥后的样品经粉碎机粉碎至粉末状，得样品7kg。将粉末过40目筛，用75％乙醇于80℃水浴锅中进行加热冷凝回流，每次2h，减压浓缩后得浸膏共2.45kg，得率为35％。将浸膏溶解于24l纯水中，经大孔吸附树脂d101以乙醇-水溶剂(乙醇:水＝0:100～90:10)梯度洗脱，收集洗脱液，每500ml为一组分，分别减压浓缩；浓缩后的洗脱物经硅胶薄层色谱(tlc)分析，合并为4个组分dh-1(87.01g)、dh-2(308.31g)、dh-3(156.44g)、dh-4(145.00g)。根据tlc分析结果，选择中等极性组分dh-3进一步分离纯化。
19.60％乙醇洗脱部位的浸膏dh-3(156.44g)经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇溶剂(二氯甲烷:甲醇＝20:1～1:1)梯度洗脱，每500ml分组收集，减压浓缩后合并，得到7个组分；将dh-3-3(17g)经prp512a树脂以乙醇-水溶剂(乙醇:水＝10:90～100:0)梯度洗脱，用250ml锥形瓶分组收集，减压浓缩合并后，得到10个组分。经tlc分析，选择dh-3-3-3(3.35g)经sephadex lh-20柱色谱，以甲醇洗脱，用10ml试管收集流分，经tlc分析合并后得到7个组分。经高效液相色谱仪(hplc)分析，选择有紫外吸收为279.4nm、222.6nm目标峰的dh-3-3-3-3(586.5mg)进一步分离纯化。dh-3-3-3-3经制备液相色谱(色谱柱：c18，流动相：55％甲醇，设置流速：8.0ml
·
min-1，检测波长230nm)进行纯化，得到化合物1(28.0mg)、2(8.2mg)。
20.化合物1pleioneside a的理化、波谱数据如下：
21.浅棕色结晶，uv(methanol)λmax:275nm；ir(kbr)νmax:3354.6,1653.7and1513.9cm-1；hresims m/z 389.13594[m+na]+(理论值：389.13589)分子式为c22h22o5。1h nmr(400mhz,methanol-d4)δh:7.01(1h,t,j＝8.0hz,h-5'),6.60(1h,d,j＝8.0hz,h-5”),6.54(3h,m,h-4',h-6',h-2”),6.47(1h,d,j＝2.1hz,h-2'),6.40(1h,dd,j＝8.0,2.0hz,h-6”),6.31(1h,t,j＝2.4hz,h-4),6.25(1h,d,j＝2.4hz,h-6),3.78(2h,s,h-α'),3.73(3h,s,-och3),2.53(2h,m,h-α),2.68(2h,m,h-β).13c nmr(100mhz,meoh-d4)δc:160.1(c-3),158.3(c-3'),157.5(c-5),145.9(c-3”),144.9(c-1'),143.8(c-1),143.8(c-4”),135.1(c-1”),130.2(c-5'),120.7(c-6'),120.4(c-6”),119.9(c-2),116.3(c-2'),116.2(c-2”),116.1(c-5”),113.7(c-4'),109.3(c-6),97.8(c-4),55.9(-och3),38.6(c-α),36.5(c-β),30.7(c-α').
[0022]
化合物2pleioneside b的理化、波谱数据如下：
[0023]
浅棕色结晶，uv(methanol)λmax:275nm；ir(kbr)νmax:3353.5,1596.9,1512.3and 1455.2cm-1；hresims m/z 373.14103[m+na]+(理论值：373.14096)分子式为c22h22o4。1h nmr(400mhz,methanol-d4)δh:6.88(3h,dd,j＝6.8,8.0hz,h-2,h-3”,h-5”),6.65(2h,d,j＝8.4hz,h-2”,h-6”),6.60(1h,d,j＝2.8hz,h-3),6.55(1h,dd,j＝2.4,8.0hz,h-6),6.14(2h,m,h-2',h-5'),6.05(1h,m,h-6'),3.75(2h,s,h-α'),3.66(3h,s,-och3),2.69(2h,m,h-β),2.50(2h,m,h-α).13c nmr(100mhz,meoh-d4)δc:162.2(c-4'),159.4(c-3'),156.8(c-5),156.4(c-4”),145.6(c-1'),142.7(c-1),133.9(c-1”),132.5(c-2),131.4(c-4),130.5(c-3”),130.5(c-5”),117.3(c-3),116.1(c-2”),116.1(c-6”),113.8(c-6),109.0(c-2'),106.3(c-6'),100.1(c-5'),55.5(-och3),38.7(c-α),38.4(c-β),36.1(c-α').
[0024]
抗氧化活性实验
[0025]
对化合物1，2进行了1,1-二苯基-2-苦基肼(dpph)自由基清除试验。取8mg dpph配成溶液，4℃避光保存。将化合物1，2和维生素c溶于乙醇，制备成浓度为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6g/l的溶液。将100μl样品和100μl dpph(0.2mmol/l)加入96孔板，一式三份。避光反应30min后，使用酶标仪在517nm处测定各孔吸光度，计算样品对dpph自由基的清除率。以维生素c为阳性对照，重复试验3次。
[0026]
化合物1的dpph自由基清除ic50值为49.72
±
0.35μm，化合物2的dpph自由基清除ic50值为56.57
±
0.47μm，对照品维生素c的53.36
±
0.68μm。结果显示，化合物1和化合物2具有良好的抗氧化活性，与对照品维生素c相当，其中化合物1的抗氧化活性略优于维生素c。
[0027]
以上所述的实施例仅表达了对本发明优选实施方式，其描述较为具体和详细，但本发明不仅限于这些实施例，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说。在未脱离本发明宗旨的前提下，所为的任何改进均落在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。