一种鸡TIPE1基因多克隆抗体的制备方法与应用

一种鸡tipe1基因多克隆抗体的制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物应用技术领域，尤其涉及一种鸡tipe1基因多克隆抗体的制备方法与应用。


背景技术：

2.脂肪肝出血综合征（fatty liver hemorrhagic syndrome，flhs）是一种以肝脏和腹腔脂肪积累过多为特征的非传染性疾病，可导致肝脏破裂、出血和猝死。它是世界上最常见的导致蛋鸡死亡的非传染性疾病，严重影响蛋鸡产蛋率，给蛋鸡养殖业造成巨大损失。flhs多发生于笼养型产蛋鸡，与营养、环境以及遗传等多种因素有关，因鸡只死亡和产蛋下降，造成严重的经济损失。
‍
在流行病学调查中显示，国内不低于40%的笼养产蛋鸡死亡与flhs有关，在很多鸡场，flhs是蛋鸡死淘的主要原因。此外，flhs与炎症、自噬和凋亡等许多生理过程密切相关。肝脂积累和损伤与肝脏炎症有关，肝脏炎症可导致肝出血，进而诱发flhs。此外，flhs可以激活炎症通路或导致肝脏自噬和凋亡的紊乱，进而诱发flhs。
3.肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8（tumor necrosis factor-α-induced protein 8 like 1，tipe1）是肿瘤坏死因子-α-诱导蛋白8（tumor necrosis factor-α-induced protein 8, tnfaip8）家族成员之一，已被证实在细胞增殖、凋亡和免疫系统疾病等过程中发挥重要作用。其中，tipe1对自噬、凋亡和脂质代谢均有显著影响。tipe1可以通过抑制p53活性或抑制自噬来促进肿瘤的增殖和进展。此外，tipe家族成员可与pip2、pip3、pip4、pa等脂质分子特异性结合，从而参与脂质和磷信号的调控。tipe1通过抑制ask1的多泛素化，抑制肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。因此，根据以往的研究，对tipe1在各种生理过程中的变化的研究一直是近期研究的重点，tipe1确实在自噬、免疫、脂质代谢等方面发挥着重要作用。尽管目前的研究发现tipe1确实参与了脂质代谢的调节，但tipe1与flhs的关系尚不清楚，对于鸡tipe1抗体的研究也尚属空白。


技术实现要素：

4.本发明实施例的目的在于提供一种鸡tipe1基因多克隆抗体的制备方法与应用，旨在解决尽管目前的研究发现tipe1确实参与了脂质代谢的调节，但tipe1与flhs的关系尚不清楚，对于鸡tipe1抗体的研究也尚属空白的问题。
5.本发明实施例是这样实现的，一种鸡tipe1基因多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：以鸡的cdna为模板，对tipe1基因进行pcr扩增反应，得到目的片段，用于pcr扩增的引物核苷酸序列为：f’：gccatggctgatatcggatccatggacaccttcagcaccaar’：gcggccgcaagcttgtcgacagtatacaacaggaggaggtcg步骤2：利用步骤1中的目的片段与大肠杆菌表达载体pet-32a(+)应用同源重组的方式进行连接反应，得到重组表达质粒pet-32a-tipe1；
步骤3：将上述步骤2中的重组表达质粒pet-32a-tipe1先转入trelief
tm 5α克隆感受态细胞，再转入bl21(de3)表达感受态细胞，得到阳性菌落；步骤4：将上述步骤3中阳性菌落进行培养，将培养后的菌液利用iptg进行诱导表达（条件：iptg浓度为0.3 mm ，18℃，18 h，150 rpm/min），经镍柱（ni-ted）纯化后获得鸡tipe1重组蛋白（咪唑洗脱浓度：200 mm）；步骤5：利用上述步骤4中鸡tipe1重组蛋白（浓度：0.667 mg/ml），对兔子进行免疫（皮内注射），免疫次数为3次，每次免疫前对兔子进行采血，最后一次免疫后12天对兔子进行采血，分离血清得到所述鸡tipe1基因多克隆抗体；步骤6：利用酶联免疫吸附试验（elisa）、蛋白免疫印记试验（western blot）、免疫组化技术（immunohistochemical，ihc）和免疫荧光技术（immunofluorescence，if）对所述鸡tipe1基因多克隆抗体进行抗体质量验证。
6.进一步的技术方案， elisa试验中：抗原包被的最佳稀释浓度为1.25 μg/ml；抗tipe1血清和免疫前血清的稀释梯度为：1:100～1:819200；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg稀释浓度为1:5000；酶标仪的反应波长为450 nm。
7.进一步的技术方案，wb试验中抗tipe1血清和免疫前血清的稀释比例为1:1000；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg的稀释比例为1:5000。
8.进一步的技术方案，ihc和if试验中抗tipe1血清和免疫前血清的稀释比例为1:500；cy3标记山羊抗兔igg的稀释比例为1：1000。
9.进一步的技术方案，所述步骤1中的pcr扩增反应条件为：预变性：94℃，2 min；变性：94℃，30 s；退火：54℃，30 s；延伸1：72℃，1 min；从变性到延伸1共35个循环；延伸2：72℃，5 min。
10.本发明实施例的另一目的在于，一种鸡tipe1基因多克隆抗体在制备蛋鸡脂肪肝出血综合征疾病检测工具中的应用，所述的鸡tipe1基因多克隆抗体是由权利要求1-5所述的制备方法制得的。
11.进一步的技术方案，所述检测工具为试剂或试剂盒。
12.本发明实施例提供的一种鸡tipe1基因多克隆抗体的制备方法与应用，通过利用鸡tipe1基因的全长核苷酸序列进行pcr扩增，后利用同源重组技术构建重组表达质粒，经iptg诱导表达出可溶性重组tipe1蛋白并进行纯化，随后将蛋白免疫兔子获得抗tipe1血清。本发明设计方法操作简便，费用成本低，制备出的可溶性蛋白大大缩短了后续纯化的时间，且免疫效果好、抗体效价高。本发明弥补了鸡tipe1抗体制备及研究的空白，为蛋鸡脂肪肝出血综合征等畜禽代谢性疾病的研究提供了新的思路，具有广泛的推广意义。
附图说明
13.图1为鸡tipe1基因多克隆抗体研制方法及其在蛋鸡脂肪肝出血综合征中应用的主要流程图；图2为克隆表达重组质粒pet-32a-tipe1的构建；图3为重组tipe1蛋白的表达与纯化；图4为elisa法测定抗tipe1血清效价；图5为荧光定量pcr法和免疫印迹法检测不同年龄段海兰褐蛋鸡在不同组织中的
表达丰度；图6为免疫荧光法检测海兰褐蛋鸡相关组织（肝、十二指肠、盲肠）tipe1蛋白表达；图7为荧光定量pcr法、免疫印迹法和免疫荧光法检测正常海兰褐蛋鸡和患flhs海兰褐蛋鸡中tipe1的表达量。
具体实施方式
14.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
15.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
16.实施例1：鸡tipe1基因多克隆抗体的制备方法与应用一、pet-32a-tipe1重组表达载体的构建，如图1和2所示（图2中， a为tipe1基因pcr扩增产物，泳道1～2为tipe1基因pcr扩增条带；b为pet-32a-tipe1质粒的菌液pcr结果图，泳道1～4为重组克隆质粒中插入tipe1基因；c为pet-32a-tipe1质粒的菌液pcr结果图，泳道1～7为重组表达质粒中插入tipe1基因）1.基于genebank中鸡源tipe1全长核苷酸序列，设计出合适的特异性引物，与鸡源模板进行结合扩增：
①
用于pcr扩增的引物核苷酸序列为：f’：gccatggctgatatcggatccatggacaccttcagcaccaar’：gcggccgcaagcttgtcgacagtatacaacaggaggaggtcg
②
pcr扩增条件为：预变性：94℃，2 min；变性：94℃，30 s；退火：54℃，30 s；延伸1：72℃，1 min；从变性到延伸1共35个循环；延伸2：72℃，5 min。
17.2.基于同源重组技术，将pet-32a载体进行双酶切反应，再利用同源重组酶将目的片段与双酶切过后的pet-32a进行连接，构建pet-32a-tipe1重组表达质粒。双酶切反应选择的限制性内切酶分别为：bamh i和sal i。
18.3.将重组表达质粒pet-32a-tipe1先转入trelief
tm
5α克隆感受态细胞，再转入bl21(de3)表达感受态细胞，得到转化后的感受态细胞。
19.二、tipe1重组蛋白的获取，（如图3所示，其中a为不同浓度诱导剂（iptg）下表达成功的tipe1蛋白，泳道1～6 iptg浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.0 mm；b为重组tipe1蛋白表达形式的鉴定，泳道1为诱导前总蛋白，泳道2为诱导后总蛋白，泳道3为超声破碎后总蛋白，泳道4为超声破碎后上清液，泳道5为超声破碎后沉淀；c和d均为不同浓度咪唑洗脱后的tipe1；c中泳道1～3洗脱浓度为50 mm，泳道4～6洗脱浓度为100 mm，泳道7～9洗脱浓度为150mm；d中泳道1～3洗脱浓度为200 mm，泳道4～6洗脱浓度为300 mm，泳道7～9洗脱浓度为500 mm)1.将上述感受态细胞进行培养，将培养后的菌液利用iptg进行诱导表达，将获得的蛋白进行15%的sds-page电泳验证，鉴定是否为所需目的蛋白。
20.其中：
①
iptg浓度为：0.3 mm；
②
诱导条件为：18℃，18 h，150 rpm/min；2.诱导表达后的tipe1蛋白进行表达形式鉴定，采用超声波破碎和离心的方法分
离其上清液和沉淀，由附图可知，重组蛋白为可溶性蛋白。
21.3.将可溶性tipe1蛋白进行镍亲和柱纯化，经15%的sds-page电泳鉴定分析。使用的洗脱液浓度为200 mm咪唑。
22.三、tipe1多克隆抗体的制备1.将获得的tipe1蛋白与等体积的弗氏佐剂混合，对兔子进行常规免疫程序。
23.其中：
①
共免疫三次，每隔十天进行加强免疫一次；
②
第一次免疫使用的为弗氏完全佐剂，第二、三次免疫使用的为弗氏不完全佐剂；
③
第三次免疫后10天，对兔子进行采血，离心获得免疫血清，即tipe1多克隆抗体。
24.四、tipe1多克隆抗体效价的测定（如图4所示，其中x轴为抗tipe1血清稀释倍数，y轴为抗tipe1血清在波长为450 nm处的数值；红色线代表待测血清，黑色线代表阴性血清；其中a为底物包被浓度为1.25 μg/ml时抗tipe1血清效价的测定；b为底物包被浓度为2.5 μg/ml时抗tipe1血清效价的测定；c为底物包被浓度为5 μg/ml时抗tipe1血清效价的测定；d为底物包被浓度为10 μg/ml时抗tipe1血清效价的测定，图5中a和b为荧光定量pcr法检测不同年龄段海兰褐蛋鸡在不同组织中的表达丰度；c、d和e为免疫印迹法检测不同年龄段海兰褐蛋鸡在不同组织中的表达丰度，图6中a为免疫荧光法检测海兰褐蛋鸡肝脏组织，a、b、c为tipe1阳性染色，d、e、f为阴性染色；b为免疫荧光法检测海兰褐蛋鸡十二指肠组织，g、h、i为tipe1阳性染色，j、k、l为阴性染色；c为免疫荧光法检测海兰褐蛋鸡盲肠组织，m、n、o为tipe1阳性染色，p、q、r为阴性染色；图7中a为荧光定量pcr法检测正常海兰褐蛋鸡和患flhs海兰褐蛋鸡中tipe1 mrna的表达量；b和c为免疫印迹法检测正常海兰褐蛋鸡和患flhs海兰褐蛋鸡中tipe1蛋白的表达量；d和e为免疫荧光法检测正常海兰褐蛋鸡和患flhs海兰褐蛋鸡中tipe1蛋白的表达量）1.将纯化的重组tipe1蛋白作为抗原稀释至不同浓度（1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml），置于96孔酶标板中（150 μl/well），4
°
c包被12小时以上。
25.2.用加了吐温的pbs（pbst）洗涤3次，在每孔中加入200 μl的5%的脱脂奶粉封闭液，37
°
c孵育2小时以上。
26.3.用pbst洗涤三次，分别加入连续稀释（1：100～1：819200）的抗tipe1血清和具有相同稀释梯度的免疫前血清（阴性对照）（100 μl/well），37
°
c孵育1小时以上。
27.4.用pbst洗涤三次，加入1：3000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg（100 μl/well）孵育1小时以上。
28.5. 用pbst洗涤三次，加入可溶型单组分tmb底物溶液避光反应20分钟，用浓硫酸终止反应，置于酶标仪内进行吸光度读取（450 nm）。
29.效价计算公式为：od阳性/od阴性≥2.1根据结果，1.25 μg/ml的抗原包被浓度可以获得最佳的抗体效价。本专利所制备的tipe1多克隆抗体抗体效价为1：102400。
30.五、免疫印迹反应提取正常幼年蛋鸡、正常成年蛋鸡和患flhs的成年蛋鸡不同组织的总蛋白，进行15%的sds-page蛋白电泳，gapdh作为内参，将制备的tipe1阳性血清和阴性血清作为一抗，山羊抗兔igg作为二抗。采用化学发光法检测蛋白条带。检测组织中的蛋白水平。
31.六、免疫荧光反应
分别将切片置于免疫后血清和免疫前血清在4℃孵育过夜，然后与异硫氰酸荧光素（fitc）偶联的山羊抗兔igg孵育。最后用4,6
ꢀ‑
二氨基-2-苯基吲哚(dapi)染色。在荧光显微镜下观察tipe1的表达和位置。
32.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。