一种提高植物抗冷性的方法

本发明涉及调节植物抗冷性的方法，具体涉及zat11和/或lox3作为靶点在调节植物抗冷能力中的应用。

背景技术：

1、木薯(manihot esculenta,crantz)是一种源自南美的粮食作物，主要用于储存淀粉的根。如今，木薯生长在南美洲、非洲和亚洲的热带地区，估计有8亿人依赖木薯作为主要的能量来源。在撒哈拉以南非洲的部分地区，木薯对粮食安全尤为重要。木薯根淀粉也用于制药、纺织、造纸和生物燃料工业。自2000年以来，木薯需求强劲，产量逐年持续增长，但潜在产量受到生物和非生物胁迫的影响。木薯是一种介于c3 和c4植物的高产作物，它不仅能充分利用光能进行高效光合作用积累淀粉，而且在恶劣环境下具有很强的抗旱能力。木薯作为一种热带块根作物，能适应各种环境刺激，但是对寒冷极其敏感。低温和冰冻条件是其地理位置和生产力最重要的限制因素。研究木薯的逆境适应机制，提高其抗逆性对提高木薯产量具有重要意义。木薯叶片暴露在光或暗的低温下会抑制最大光合速率和表观量子产量。一些研究报道了木薯对寒冷反应的生理、生化和分子变化。例如，研究了木薯对低温的转录组应答和增强ros 清除能力改善了木薯对低温胁迫的抵抗能力。

2、迄今为止，对木薯冷反应的内源性基因调控的研究很少。随着基因组测序技术的发展和木薯基因组测序的完成，为基因组注释、分类及比较基因组研究提供了机会。 2012年，研究人员对低温处理下木薯的转录物组变化进行了研究，发现了一系列低温差异表达基因。这些差异表达基因的生物学功能多种多样，包括信号传导、转录因子、ros清除酶、光合作用相关的基因等。

技术实现思路

1、木薯富含淀粉，对低温敏感，低温寒害给木薯产业造成严重的影响，但其内在调控机制尚不清楚。本发明通过对冷胁迫转录组分析，鉴定到明显受诱导的 c2h2类转录因子mezat11，通过基因工程的手段对该基因进行干扰，干扰的木薯植株明显提高了其抗冷能力。进一步对mezat11下游的调控元件分析，发现质膜流动性相关的基因melox3受其调控；并利用酵母单杂和双荧光验证 mezat11对melox3的调控。本发明不仅获得了抗冷的新种质，也解析了木薯 zat11响应冷胁迫的内在机制。

2、本发明第一个方面提供一种调节植物抗冷能力、调节膜流动性、衰老响应、活性氧积累、叶绿素含量、叶绿素降解基因的表达或活性、衰老相关基因的表达或活性、 ja含量的方法，包括步骤：调节植物中zat11和/或lox3的表达或活性。

3、在一个或多个实施方案中，叶绿素含量是叶绿素a或叶绿素b的含量。

4、在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟科植物，优选是木薯属植物，更优选为木薯。

5、在一个或多个实施方案中，zat11和/或lox3源自大戟科植物，优选源自木薯属植物，更优选源自木薯。

6、在一个或多个实施方案中，叶绿素降解基因包括选自以下的一种或多种：nyc1、pph、rccr。

7、在一个或多个实施方案中，衰老相关基因包括sag39、icl1或icl2，优选为 icl1。

8、在一个或多个实施方案中，zat11和/或lox3的表达或活性下调，植物抗冷能力增强、衰老延缓、膜流动性上调、活性氧积累减少、叶绿素a含量增加、叶绿素b 含量增加、nyc1下调、pph下调、rccr下调、icl1下调、ja含量增加。

9、在一个或多个实施方案中，zat11和/或lox3的表达或活性上调，植物抗冷能力减弱、衰老增速、膜流动性下调、活性氧积累增多、叶绿素a含量减少、叶绿素b 含量减少、nyc1上调、pph上调、rccr上调、icl1上调、ja含量减少。

10、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中zat11和/或lox3的表达或活性包括：

11、(1)将zat11和/或lox3基因转入植物，获得转化的植物；和/或

12、(2)将zat11和/或lox3基因或编码蛋白的促进剂与植物接触。

13、在一个或多个实施方案中，所述zat11和/或lox3基因包括cdna序列、基因组序列、或其组合。

14、在一个或多个实施方案中，zat11的氨基酸序列选自以下的一种或多种：(a)具有seq id no:1所示序列的多肽；(b)将seq id no:1所示序列经过一个或多个(如 1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

15、在一个或多个实施方案中，lox3的氨基酸序列选自以下的一种或多种：(a)具有seq id no:2所示序列的多肽；(b)将seq id no:2所示序列经过一个或多个(如 1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

16、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中zat11和/或lox3的表达的方法包括：

17、(1)提供携带含有zat11和/或lox3基因的核酸构建物的农杆菌，

18、(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

19、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

20、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中zat11和/或lox3活性的表达的方法还包括：(3)选择出转入了zat11和/或lox3基因的植物组织、器官或种子；和 (4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

21、在一个或多个实施方案中，所述下调zat11和/或lox3的表活或活性包括：将下调zat11和/或lox3基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

22、在一个或多个实施方案中，所述抑制剂包括特异性干扰zat11和/或lox3基因转录和/或表达、或下调zat11和/或lox3活性的抑制分子。

23、在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以zat11和/或lox3基因或其转录本或表达蛋白作为抑制靶标。优选地，所述抑制分子以seq id no:1和/或seq id no:2或其编码序列(dna或rna)作为抑制靶标。

24、在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、dsrna、sgrna、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以zat11和/或 lox3基因或其转录本作为抑制靶标的dsrna或其构建物。

25、在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲除或敲减zat11和/或lox3基因的试剂，例如sgrna。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含cas酶(例如cas9)、其编码序列、和/或表达所述cas酶的核酸构建物。

26、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中zat11和/或lox3表达的方法包括：

27、(i)提供携带可干扰zat11和/或lox3基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生所述抑制剂；

28、(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

29、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

30、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中zat11和/或lox3表达的方法还包括：

31、(iii)选择出转入了所述核酸构建物的植物组织、器官或种子；和

32、(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

33、本发明另一方面提供一种调节脂氧合酶3(lox3)的方法，包括步骤：调节zat11 的表达或活性。

34、在一个或多个实施方案中，所述zat11的表达或活性上调，脂氧合酶3的表达或活性上调。

35、在一个或多个实施方案中，所述zat11的表达或活性下调，脂氧合酶3的表达或活性下调。

36、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中zat11的表达或活性包括：

37、(1)将zat11基因转入植物，获得转化的植物；和/或

38、(2)将zat11基因或编码蛋白的促进剂与植物接触。

39、在一个或多个实施方案中，所述zat11基因包括cdna序列、基因组序列、或其组合。

40、在一个或多个实施方案中，zat11的氨基酸序列选自以下的一种或多种：(a)具有seq id no:1所示序列的多肽；(b)将seq id no:1所示序列经过一个或多个(如 1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

41、在一个或多个实施方案中，lox3的氨基酸序列选自以下的一种或多种：(a)具有seq id no:2所示序列的多肽；(b)将seq id no:2所示序列经过一个或多个(如 1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

42、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中zat11的表达的方法包括：

43、(1)提供携带含有zat11基因的核酸构建物的农杆菌，

44、(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

45、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

46、在一个或多个实施方案中，所述上调植物中zat11活性的表达的方法还包括： (3)选择出转入了zat11基因的植物组织、器官或种子；和(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

47、在一个或多个实施方案中，所述下调zat11的表活或活性包括：将下调zat11 基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

48、在一个或多个实施方案中，所述抑制剂包括特异性干扰zat11基因转录和/或表达、或下调zat11活性的抑制分子。

49、在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以zat11基因或其转录本或表达蛋白作为抑制靶标。优选地，所述抑制分子以seq id no:1或其编码序列(dna或rna) 作为抑制靶标。

50、在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、dsrna、sgrna、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以zat11基因或其转录本作为抑制靶标的dsrna或其构建物。

51、在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲除或敲减zat11基因的试剂，例如sgrna。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含cas酶(例如cas9)、其编码序列、和/或表达所述cas酶的核酸构建物。

52、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中zat11表达的方法包括：

53、(i)提供携带可干扰zat11基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生所述抑制剂；

54、(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

55、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

56、在一个或多个实施方案中，所述下调植物中zat11表达的方法还包括：

57、(iii)选择出转入了所述核酸构建物的植物组织、器官或种子；和

58、(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

59、本发明另一方面提供一种在植物中下调zat11和/或lox3的表达或活性、增强抗冷能力、延缓植物衰老、上调膜流动性、减少活性氧积累、增加叶绿素a含量增加、增加叶绿素b含量增加、下调叶绿素降解基因的表达或活性、下调衰老相关基因的表达或活性的方法，包括步骤：使用ja或其类似物或衍生物处理植物。

60、在一个或多个实施方案中，ja的衍生物是茉莉酸烷基酯，优选茉莉酸甲酯。

61、在一个或多个实施方案中，叶绿素降解基因包括选自以下的一种或多种：nyc1、pph、rccr。

62、在一个或多个实施方案中，衰老相关基因包括sag39、icl1或icl2，优选为 icl1。

63、在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟科植物，优选是木薯属植物，更优选为木薯。

64、在一个或多个实施方案中，ja或其类似物或衍生物的浓度为至少1μm，例如至少5、10、15、或20μm，优选约5-50μm。

65、在一个或多个实施方案中，所述处理至少1小时，例如至少3、6、9或12小时，优选至少6小时。

66、在一个或多个实施方案中，所述处理包括处理植物的根、茎、叶、花、果实或种子。

67、本发明另一方面提供zat11和/或lox3作为靶点在调节植物抗冷能力、调节膜流动性、衰老响应、活性氧积累、叶绿素含量、叶绿素降解基因的表达或活性、衰老相关基因的表达或活性、ja含量中的应用。

68、在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟科植物，优选是木薯属植物，更优选为木薯。

69、在一个或多个实施方案中，zat11和/或lox3源自大戟科植物，优选源自木薯属植物，更优选源自木薯。

70、在一个或多个实施方案中，叶绿素降解基因包括选自以下的一种或多种：nyc1、pph、rccr。

71、在一个或多个实施方案中，衰老相关基因包括sag39、icl1或icl2，优选为 icl1。

72、本发明另一方面提供物质在调节植物抗冷能力、调节膜流动性、衰老响应、活性氧积累、叶绿素含量、叶绿素降解基因的表达或活性、衰老相关基因的表达或活性、 ja含量中的用途，所述物质选自下组：zat11和/或lox3基因或编码蛋白、或其促进剂或抑制剂。

73、在一个或多个实施方案中，叶绿素含量是叶绿素a或叶绿素b的含量。

74、在一个或多个实施方案中，所述植物是大戟科植物，优选是木薯属植物，更优选为木薯。

75、在一个或多个实施方案中，叶绿素降解基因包括选自以下的一种或多种：nyc1、pph、rccr。

76、在一个或多个实施方案中，衰老相关基因包括sag39、icl1或icl2，优选为 icl1。

77、在一个或多个实施方案中，zat11和/或lox3源自大戟科植物，优选源自木薯属植物，更优选源自木薯。

78、在一个或多个实施方案中，所述物质是zat11和/或lox3的表达或活性的促进剂，从而植物抗冷能力减弱、衰老增速、膜流动性下调、活性氧积累增多、叶绿素 a含量减少、叶绿素b含量减少、nyc1上调、pph上调、rccr上调、icl1上调、 ja含量减少。

79、在一个或多个实施方案中，所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。优选地，所述核酸分子是含有zat11和/或lox3编码序列的核酸构建物。所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

80、在一个或多个实施方案中，所述zat11和/或lox3基因包括cdna序列、基因组序列、或其组合。

81、在一个或多个实施方案中，zat11的氨基酸序列选自以下的一种或多种：(a)具有seq id no:1所示序列的多肽；(b)将seq id no:1所示序列经过一个或多个(如 1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

82、在一个或多个实施方案中，lox3的氨基酸序列选自以下的一种或多种：(a)具有seq id no:2所示序列的多肽；(b)将seq id no:2所示序列经过一个或多个(如 1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

83、在一个或多个实施方案中，所述物质是zat11和/或lox3的表达或活性的抑制剂，从而植物抗冷能力增强、衰老延缓、膜流动性上调、活性氧积累减少、叶绿素 a含量增加、叶绿素b含量增加、nyc1下调、pph下调、rccr下调、icl1下调、ja含量增加。

84、在一个或多个实施方案中，所述抑制剂包括特异性干扰zat11和/或lox3基因转录和/或表达、或下调zat11和/或lox3活性的抑制分子。

85、在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以zat11和/或lox3基因或其转录本或表达蛋白作为抑制靶标。优选地，所述抑制分子以seq id no:1和/或seq id no:2或其编码序列(dna或rna)作为抑制靶标。

86、在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microrna、sirna、shrna、dsrna、sgrna、特异性抗体或配体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以zat11和/或 lox3基因或其转录本作为抑制靶标的dsrna或其构建物。

87、在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是使用选自zfn、talen和crispr的技术敲除或敲减zat11和/或lox3基因的试剂，例如sgrna。在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含cas酶(例如cas9)、其编码序列、和/或表达所述cas酶的核酸构建物。所述核酸构建物是表达载体或整合载体。

88、本发明另一方面提供抑制zat11和/或lox3基因表达的多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建物，所述多核苷酸具有：(1)seq id no:3所示的序列或其相应rna序列，或与其具有至少90％序列相同性的序列，

89、(2)源自(1)的sirna，或

90、(3)含有式i所示的结构：

91、seq正向-x-seq反向         式i，

92、式i中，seq正向为(1)或(2)所示序列，seq反向为与seq正向反向互补的多核苷酸；

93、x为位于seq正向和seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与seq正向和 seq反向不互补。

94、在一个或多个实施方案中，sirna长度为10-35bp，优选15-30bp。

95、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是载体。