一种火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法

1.本发明涉及生物活性肽领域。具体是一种火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法。


背景技术：

2.痛风是一种以高尿酸血症为主要危险因素的慢性疾病，是由于尿酸生成过量或排泄紊乱，导致尿酸盐晶体在滑膜、滑囊、软骨等关节组织沉积而引起。据统计，痛风在世界范围内的发病率为0.06％-2.68％，在我国仅次于ii型糖尿病的发病率，是最普遍、最严重的代谢疾病之一，危害人们的健康。临床上应用的抗痛风药物有别嘌呤醇、非布司他、秋水仙碱等抑制尿酸生成或促进尿酸排泄的药物。然而，这些化学药物的肾毒性、皮炎、过敏反应等毒副反应给痛风患者带来健康隐患。目前迫切需要开发更多绿色健康和安全的抗痛风药物。从天然存在的蛋白质中提取的降尿酸肽，通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性减少尿酸生成，或促进尿酸在肾脏的排泄达到治疗痛风或高尿酸血症的目的，具备天然低毒、易吸收和补充营养的优势，是更加绿色健康的治疗和预防方式。
3.火麻仁作为一种药食同源的材料，富含人体必需氨基酸。其蛋白及降解产物具有降血糖、抗氧化、抗肿瘤和增强人体免疫力等多种功效，是一种完全优质的蛋白。已经有报道称火麻仁蛋白水解物具有特定的生物活性，包括抗氧化、抗高血压、调节肾脏疾病、抑制乙酰胆碱酯酶，抑制α-葡萄糖苷酶和二肽基肽酶iv(dpp iv)、抗癌、抗疲劳、抗炎、抗高胆固醇血症、神经保护和调节脂质代谢紊乱，但迄今为止尚未见到火麻仁蛋白及其水解物抗痛风作用的相关报道。因此，以火麻仁蛋白为来源制备抗痛风肽，特别是针对痛风的关键靶点酶-黄嘌呤氧化酶，英文名称为xanthine oxidase，简写为xod或xo的抑制肽具有很大的潜力和明显的创新价值。
4.制备生物活性肽的方法主要为酶解法，微生物发酵法，无需以食物蛋白作为原料、直接化学合成目标多肽的固相合成法以及基因重组法等。但是这些方法存在不足之处，例如，以固相合成法为代表的化学合成法，通常作为验证新肽的标准方法，但是，保护碱基和脱保护步骤繁琐，而且多周期和复杂的纯化过程也阻碍了其大规模的工业应用。蛋白酶水解法是从蛋白质中制备功能性多肽应用最广泛的方法，但缺点是水解过程不可控、目标肽含量低、纯化成本高、蛋白提取率低等。随着科学技术的不断发展，利用计算机技术筛选设计生物活性肽的研究逐渐增加，它较好地克服了传统方法的不足，可实现高通量筛选生物活性肽的目标。然而迄今为止，尚未开展利用计算机虚拟筛选火麻仁来源黄嘌呤氧化酶抑制肽的相关研究以及对火麻仁来源的黄嘌呤氧化酶抑制肽进行表征。


技术实现要素：

5.本发明首次公开一种火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽及其制备方法，黄嘌呤氧化酶抑制肽其氨基酸序列如seq id no:1所示，为asp-asp-asn-pro-arg-arg-phe-tyr，单字母简写为ddnprrfy，半抑制浓度ic
50
为2.10
±
0.06mg/ml，ki值为0.48
±
0.02mg/ml，表现为一种
混合型抑制剂，能够持续稳定地抑制黄嘌呤氧化酶的活性。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：一种火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)利用在线工具biopep-uwm对火麻仁蛋白进行虚拟酶解，得到火麻仁多肽库；
8.(2)通过peptideranker、innovagen、toxinpred和admetsar程序对酶解后的的火麻仁多肽的生物活性、水溶性、毒性、admet性质进行评价，筛选出活性较高、水溶性好、无毒性且admet性质良好的火麻仁多肽，建立火麻仁活性多肽肽库；
9.(3)利用分子对接技术评价多肽与黄嘌呤氧化酶的结合方式，高通量筛选得到具有潜在黄嘌呤氧化酶抑制活性的候选火麻仁多肽序列；
10.(4)采用固相化学合成方法和抑制活性验证实验，对候选火麻仁多肽序列进行验证，得到所述新型黄嘌呤氧化酶抑制肽；
11.(5)采用计算机虚拟酶解对应的蛋白酶，对火麻仁蛋白进行酶解得到所述新型黄嘌呤氧化酶抑制肽。
12.步骤(1)所述利用在线工具biopep-uwm对火麻仁蛋白进行虚拟酶解，选择的蛋白酶包括：chymotrypsin，trypsin，pepsin，proteinase k，pancreatic elastase,prolyl oligopeptidase,v-8 protease,thermolysin,chymotrypsin c,plasmin,cathepsin g,clostripain,chymase,papain,ficin,leukocyte elastase,metridin,thrombin,pancreatic elastase ii,stem bromelain,glutamyl endopeptidase ii,oligopeptidase b,calpain 2,glycyl endopeptidase,oligopeptidase f,proteinase p1,xaa-pro dipeptidase，coccolysin,subtilisin的蛋白酶，对火麻仁蛋白进行虚拟酶解，得到火麻仁多肽库。
13.步骤(3)所述利用moe分子对接技术评价多肽与黄嘌呤氧化酶的结合方式，高通量筛选得到具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的候选火麻仁多肽序列，包括氨基酸序列如seq id no:2，seq id no:3，seq id no:4，seq id no:5，seq id no:6，seq id no:7，seq id no:8所示的多肽，分别对应prrfyi、ywcnndg、ddnprrfy、egfewvsfk、pyy、fcffl、qschfrtp、saddednyyygg，优选的是ddnprrf、ywcnndg，egfewvsfk、pyy，更优选的是ddnprrfy。
14.步骤(4)所述采用固相化学合成方法和抑制活性验证实验，对候选火麻仁多肽序列进行验证，得到所述黄嘌呤氧化酶抑制肽，序列如seq id no:1所示，其半抑制浓度ic
50
为2.10
±
0.06mg/ml，ki值为0.48
±
0.02mg/ml，表现为一种混合型抑制剂，能够持续稳定的抑制黄嘌呤氧化酶的活性。
15.步骤(5)所述采用计算机虚拟酶解对应的蛋白酶，对火麻仁蛋白进行酶解得到所述新型黄嘌呤氧化酶抑制肽，是选用pancreatic elastase对火麻仁蛋白进行酶解，制备新型黄嘌呤氧化酶抑制肽，氨基酸序列如seq id no:1所示。
16.与现有的技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
17.(1)首次开展火麻仁蛋白来源抗痛风肽的研究，公开了一种火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽。该抑制肽ddnprrfy的半抑制浓度ic
50
为2.10
±
0.06mg/ml，ki值为0.48
±
0.02mg/ml，表现为一种混合型抑制剂，能够持续稳定地抑制黄嘌呤氧化酶的活性。
18.(2)首次利用计算机虚拟酶解蛋白和分子对接技术筛选火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽，比传统蛋白酶随机切割结合抑制活性筛选的方法更为高效、快速筛选得到新型的黄嘌
呤氧化酶抑制肽。
19.(3)本发明利用虚拟筛选火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽的结果，选用对应的pancreatic elastase蛋白酶水解火麻仁蛋白，定向制备火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽的方法，为首次报道。
附图说明
20.图1为实施例2中ddnprrfy-xo分子对接2d和3d模型图。
21.图2为实施例4中ddnprrfy肽的xo抑制活性验证图。
22.图3中的(a)为实施例5中ddnprrfy肽的酶促反应速率曲线图；(b)为实施例5中ddnprrfy肽的lineweaver-burk图。
23.图4为由lineweaver-burk计算的线性拟合斜率k与ddnprrfy浓度的关系图。
24.图5为实施例6中火麻仁酶解物纯化组分多肽的质谱鉴定结果图。
25.具体实施方法
26.以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
27.实施例1
28.利用计算机技术虚拟酶解火麻仁蛋白构建生物活性肽库
29.通过ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载火麻仁球蛋白和火麻仁清蛋白，蛋白信息见表1。通过biopep-uwm(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)程序，使用数据库中的蛋白酶对上述蛋白进行酶解。选用的蛋白酶包括chymotrypsin，trypsin，pepsin，proteinase k，pancreatic elastase,prolyl oligopeptidase,v-8 protease,thermolysin,chymotrypsin c,plasmin,cathepsin g,clostripain,chymase,papain,ficin,leukocyte elastase,metridin,thrombin,pancreatic elastase ii,stem bromelain,glutamyl endopeptidase ii,oligopeptidase b,calpain 2,glycyl endopeptidase,oligopeptidase f,proteinase p1,xaa-pro dipeptidase，coccolysin,subtilisin，共29种。然后通过peptideranker(http://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/serverpages/peptideranker.php)程序对酶解多肽进行生物活性预测，得到评分介于0-1之间，评分越接近于1表示成为生物活性肽的可能性越高。使用innovagen(http://www.innovagen.com/proteomics-tools)预测活性肽的水溶性，利用admetsar(http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/)预测活性肽的吸收、分布、代谢、排泄和毒性性质。最终筛选得到无毒、水溶性较好且admet性质优良的247种生物活性肽，成功构建了火麻仁活性肽配体库。
30.表1原料蛋白质信息
[0031][0032]
实施例2
[0033]
分子对接靶向筛选黄嘌呤氧化酶抑制肽
[0034]
利用chemsketch10.0软件绘制火麻仁配体库的多肽结构。优化后将结构保存为mol格式，并加载到moe分子模拟软件中。在调整其电荷和结构后，经过3d质子化和能量最小化，将其保存下来。从protein data bank(https://www.rcsb.org/)获得xod(pdb id:3nvy)的晶体结构，并根据其催化机理选择活性位点。利用moe中的site finder生成xod的活性位点，采用triangle matcher法将配体放置在位点上，根据london dg评分函数进行排序，然后通过诱导拟合进行对接，使用affinity dg评分函数优化能量。从对接结果来看，得分越低，亲和度越高，xo与火麻仁肽的相互作用越强，对xo的潜在抑制作用越强。通过评分结果筛选得到8种xo抑制作用较好的多肽(见表2)。其中ddnprrfy的对接分数最低，与xo结合稳定，潜在的xo抑制活性较高，它主要与xo中的leu1138、glu879、thr1010、lys771、glu802、arg1134、leu873、ser1141形成氢键相互作用，与leu1014形成疏水相互作用以及与phe914形成π-π堆积相互作用(见图1)。8条火麻仁多肽序列均为未曾报道过的新肽。prrfyi、ddnprrfy、fcffl、pyy均为利用弹性蛋白酶虚拟酶解得到的xo抑制肽。
[0035]
表2多肽抑制剂与xo之间的相互作用以及对接评分结果
[0036][0037]
实施例3
[0038]
火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽对xo抑制活性的检测
[0039]
委托上海波肽生物有限公司，利用固相法化学合成实施例2种筛选的8条火麻仁多肽，并经过高效液相色谱(hplc)和质谱检测鉴定，其纯度》98％。对化学合成的8种肽，进行体外抑制xo活性的测定，测定体系见表3。用酶标仪在3min内测量295nm处的xo抑制率。xo抑
制率＝[(da/dt)抑制剂-(da/dt)空白]/(da/dt)空白x100％，其中(da/dt)抑制剂和(da/dt)空白分别为有抑制剂和无抑制剂时的反应速率，xo酶活力单位(u)定义为在测定温度和ph值条件下每分钟转化生成lμmol尿酸所需要的酶量。测定结果如表4所示：当质量浓度为1.0mg/ml时，ddnprrfy是8种肽之中xo抑制效果最好的多肽，其抑制率为30.30％，其次是ywcnndg，egfewvsfk和pyy抑制率均为18％。有两种肽在这三种质量浓度下没有抑制活性，分别是qschfrtp和saddednyyygg。qschfrtp激活率随着浓度上升而不断下降。
[0040]
表3测定xo酶活反应体系的组成
[0041][0042]
表4化学合成肽xo抑制活性验证效果
[0043][0044]
(注：负数表示激活作用，正数表示抑制作用。)
[0045]
实施例4
[0046]
黄嘌呤氧化酶抑制肽ddnprrfy的半抑制浓度测定
[0047]
对新型ddnprrfy的xo抑制活性进行进一步表征。设置抑制肽的浓度梯度为0.08、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2mg/ml，酶活测定体系和测定方法如表3和实施例3所示，测定结果见图2。ddnprrfy的xo抑制活性呈浓度依赖性关系，通过spss计算其ic
50
值为2.10
±
0.06mg/ml(相当于1.94mm)。与已经研究报道的降尿酸活性肽相比，ddnprrfy肽的xo抑制效果较好。
[0048]
实施例5.
[0049]
黄嘌呤氧化酶抑制肽ddnprrfy的抑制动力学研究
[0050]
在酶促反应的体系中，参加反应的各个物质的体积和浓度不发生改变，固定酶浓
度为0.025u/ml，作为底物的黄嘌呤的浓度设置为0.064、0.16、0.256、0.32、0.48、0.64mmol/l。按照实施例3的方法测定不同浓度的xo抑制肽(0、0.8、1.6、2.4mg/ml)对黄嘌呤氧化酶的酶促反应速率。以“v”对“[s]”作图，抑制肽的每一质量浓度对应一系列点，利用酶动力学方程对其进行非线性拟合，拟合方程系数与抑制剂浓度存在对应函数关系，结果见图3所示。不同斜率的直线在第二象限相交，随着抑制肽浓度增加，表观米氏常数km逐渐增加，由0.058增加至0.093。而最大反应速率v
max
逐渐减小，由0.030降低至0.026(如表5所示)。这表明该肽的抑制类型为混合型(介于竞争和非竞争性抑制)抑制剂。ki值可以根据lineweaver-burk曲线的斜率与对应的ddnprrfy肽质量浓度的关系图计算得出。结果如图4所示，该直线的拟合延长线交横轴于-0.48，得出ddnprrfy的抑制动力学常数ki值为0.48
±
0.02mg/ml，抑制剂常数较小，表明该肽对xo的亲和力较强。
[0051]
表5 ddnprrfy肽抑制动力学参数及统计分析
[0052][0053]
实施例6
[0054]
pancreatic elastase酶解火麻仁蛋白定向制备火麻仁黄嘌呤氧化酶抑制肽
[0055]
选取商品化pancreatic elastase与巴马特色的火麻仁蛋白粉，通过响应面实验优化酶解的工艺条件，提高火麻仁蛋白酶解物对xo抑制效果，之后进行分离纯化实验得到具有xo抑制活性肽，对纯化后的多肽利用lc-ms/ms进行鉴定，结果见图5所示，经过sequest搜索，共鉴定得到6条多肽：innqnqldmsprrfyi、kmaekegfewvsfktndra、renigdpsradv、rqpnrrveceagv、qqnglhlpsytntpql、rqgqivtvpqnha。与前期的虚拟筛选结果对比分析，进一步确认火麻仁蛋白水解物的xo抑制效果，测定结果如表6所示：所有鉴定的多肽经胃肠道吸收较好且多肽都无毒性和致癌性，研究发现innqnqldmsprrfyi包含了前期筛选得到的xo抑制肽ddnprrfy和prrfyi，而kmaekegfewvsfktndra包含了筛选得到的多肽egfewvsfk，并且化学合成这三种肽都有xo抑制活性，验证后发现ddnprrfy的抑制活性最好。进一步证明利用弹性蛋白酶酶解火麻仁蛋白可以定向制备出虚拟筛选鉴定的xo抑制肽，火麻仁蛋白水解物可以作为治疗高尿酸血症的候选药物，为治疗高尿酸血症提供新的研究方向。
[0056]
表6 lc-ms/ms鉴定的多肽胃肠道消化模拟评价
[0057][0058]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式。都包含在本发明的保护范围之内。