技术特征：
1.一种同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖的方法，步骤是：(1)制备红发夫酵母来源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv基因表达盒：以黑曲霉atcc 20611的基因组dna为模板，以fopa-1uf/fopa-1r为引物扩增β-呋喃果糖苷酶fopa编码基因启动子及信号肽基因pfopa-sp；然后将β-呋喃果糖苷酶fopa编码基因启动子及信号肽基因pfopa-sp、xd-inv编码基因、终止子基因ttrpc、抗性基因prta按顺序连接，制得能随机整合进入黑曲霉atcc 20611基因组中表达xd-inv蛋白的xd-inv表达盒，其中所述xd-inv表达盒的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述β-呋喃果糖苷酶fopa编码基因启动子及信号肽基因pfopa-sp的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述xd-inv编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述的终止子ttrpc基因来源于质粒pan7-1；所述的抗性基因prta扩增于质粒t-prta；所述引物核苷酸序列如下：fopa-1uf：attgtgtcattatagctctttct；fopa-1r：tgaggcttctgctgctgc；(2)构建共表达异源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv和β-呋喃果糖苷酶fopa的工程菌株：制备黑曲霉atcc 20611的原生质体，将红发夫酵母来源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv基因表达盒转化进入黑曲霉atcc 20611的原生质体，经筛选、验证，验证正确的菌株命名为共表达异源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv和β-呋喃果糖苷酶fopa的工程菌株incf-1；(3)发酵生产6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv和β-呋喃果糖苷酶fopa：将活化后的工程菌株incf-1以106个/ml的数量接种到发酵培养基中，在温度30
±
3℃、转速180-220r/min条件下发酵1-7天，即得到含异源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv和β-呋喃果糖苷酶fopa的菌丝体；其中，所述发酵培养基配方是：蔗糖38
±
2g/l，酵母膏3
±
1g/l，nano
3 4
±
1g/l，k2hpo
4 0.4
±
0.2g/l，mgso47h2o 0.5
±
0.1g/l，feso
4 0.01
±
0.05g/l，cuso
4 0.01
±
0.05g/l，ph 4.5
±
1.0，115℃，灭菌30min；(4)利用含β-呋喃果糖苷酶菌丝体同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖：测定得到的含酶菌丝体的总酶活，确定制备低聚果糖的反应体系为：400-446u/g酶的菌丝体量为7-35g/l，蔗糖浓度为200-600g/l，温度为20-60℃，转速为150-200r/min；反应5-30h即获得含新科斯糖和1f-低聚果糖的反应液。2.根据权利要求1所述同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述发酵培养基配方是：蔗糖40g/l，酵母膏3g/l，nano
3 5g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso47h2o 0.5g/l，feso
4 0.01g/l，cuso
4 0.01g/l，ph 5.0。3.根据权利要求1所述同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖的方法，其特征在于：步骤(3)所述工程菌株incf-1的发酵条件是：温度为30℃，转速为200r/min，发酵时间为2天。4.根据权利要求1所述同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖的方法，其特征在于：步骤(4)所述制备低聚果糖的反应体系为：400-446u/g酶的菌丝体量为14g/l，蔗糖浓度为500g/l，温度为50℃，转速为180r/min；反应5h即获得含新科斯糖和1f-低聚果糖的反应液。5.一种用于同时制备新科斯糖和1f-低聚果糖的工程菌株，其特征在于：所述菌株能表达异源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv和β-呋喃果糖苷酶fopa，其是以黑曲霉atcc 20611为出发菌株，在其基因组中整合加入如seq id no.1所示的能表达xd-inv蛋白的xd-inv表达盒制得，命名为共表达异源6g-β-呋喃果糖苷酶xd-inv和β-呋喃果糖苷酶fopa的工程菌株incf-1；其中所述xd-inv表达盒是将β-呋喃果糖苷酶fopa编码基因启动子及信号肽基因
pfopa-sp、xd-inv编码基因、终止子基因ttrpc、抗性基因prta按顺序连接构建获得。6.一种用于构建权利要求5所述工程菌株的表达xd-inv蛋白的表达盒，其特征在于：所述表达盒命名为xd-inv表达盒，其是将β-呋喃果糖苷酶fopa编码基因启动子及信号肽基因pfopa-sp、xd-inv编码基因、终止子基因ttrpc、抗性基因prta按顺序连接构建获得，该表达盒的核苷酸序列如seq id no.1所示。7.一种用于构建权利要求5所述工程菌株的启动子及信号肽基因，其特征在于：所述启动子及信号肽基因是β-呋喃果糖苷酶fopa编码基因启动子及信号肽基因pfopa-sp，该启动子为蔗糖诱导型启动子，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
技术总结
本发明公开了一种同时制备新科斯糖和1F-低聚果糖的方法，是制备红发夫酵母来源6G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV基因表达盒，将该表达盒转化进入黑曲霉ATCC 20611构建共表达异源6G-β-呋喃果糖苷酶Xd-INV和β-呋喃果糖苷酶FopA的工程菌株INCF-1，并发酵生产含Xd-INV和FopA的菌丝体，利用制得的菌丝体以蔗糖为底物同时制备新科斯糖和1F-低聚果糖。实验证实：本发明构建的工程菌发酵产的含β-呋喃果糖苷酶(Xd-INV和FopA)菌丝体酶活力可达到446.72U/g，菌丝体直接用于制备新科斯糖和1F-低聚果糖，产量达349.8g/L，具有较高的应用和推广价值，有助于扩大低聚果糖的产业化进程。有助于扩大低聚果糖的产业化进程。有助于扩大低聚果糖的产业化进程。
技术研发人员：钟耀华 万秀芬 张静
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/7/29