猪褪黑素受体MTNR1B及其应用

本发明涉及基因工程，具体涉及分离的猪褪黑素受体mtnr1b及其应用。

背景技术：

1、褪黑素(n-乙酰基-5-甲氧基色胺，mt)也被称为“脑白金”，主要是由哺乳动物松果体、卵巢等器官合成分泌的一种重要的吲哚类活性小分子物质，其广泛分布于动物多个组织中。褪黑素是一种十分重要的内分泌激素，其合成受到光照的抑制，呈现昼低夜高的节律振荡，因而也被称为“黑暗荷尔蒙”。褪黑素具有多种生理学和药理学功能，比如改善睡眠，调节生物节律，缓解应激，调节免疫系统，增强免疫力，抗肿瘤，抗衰老等。另外，褪黑素也是一种关键的生殖激素，在动物繁殖活动中直接或间接调控生殖激素的分泌、睾丸发育、卵泡发育、胚胎发育及附植等，也参与了季节性发情动物发情周期的调控。

2、褪黑素发挥重要生理作用需要其受体介导。褪黑素受体属于g蛋白偶联受体(gpcr)超家族。褪黑素受体包括三个成员，结合褪黑素的mtnr1a(也叫mt1)和mtnr1b(也叫mt2)，以及与mtnr1a和mtnr1b具有高度序列同源性但不结合褪黑素或其他任何已知配体的受体gpr50。

3、但是，目前还没有关于猪(sus scrofa)的mtnr1b基因完整编码区(cds)的报道，ncbi数据库中仅有mtnr1b基因的部分mrna。这样导致所使用的引物并非mtnr1b特异的，扩增产物中可能同时含有同源的mtnr1a和gpr50，定量结果并不准确，也阻碍了对猪褪黑素的相关研究。

技术实现思路

1、本公开的目的在于提供猪(sus scrofa)的褪黑素受体mtnr1b蛋白及其编码基因。本公开具体提供了猪褪黑素受体mtnr1b蛋白，及其编码基因的完整的编码区(cds)。

2、根据本公开的一个方面，提供了一种蛋白质，其具有：如seq id no:3所示的氨基酸序列；或，在如seq id no:3所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且能结合褪黑素的氨基酸序列。

3、根据一些实施方式，所述蛋白质为猪褪黑素受体mtnr1b。

4、根据一些实施方式，所述蛋白质在如seq id no:3所示的氨基酸序列的第241位酪氨酸可以突变至半胱氨酸(y241c)。

5、根据一些实施方式，所述蛋白质的n末端或者c末端可以连接有标签序列。根据具体的实施方式，所述标签序列可以选自，但并不限于，flag、ha、myc、poly-his、gst(谷胱甘肽巯基转移酶)、strep、avitag、gfp(绿色荧光蛋白)、egfp、ecfp、eyfp、mbp(麦芽糖结合蛋白)、halo、sumo(小分子泛素样修饰蛋白)等。

6、根据本公开的另一方面，提供了一种基因，其编码如seq id no:3所示的氨基酸序列。

7、根据一些实施方式，所述基因为编码猪(sus scrofa)褪黑素受体mtnr1b的基因。

8、根据一些实施方式，所述基因具有如seq id no:2所示的核酸序列。根据一些实施方式，所述基因具有，在严格条件下与如seq id no:2所示的核酸序列杂交的核酸序列。根据一些实施方式，所述猪褪黑素受体mtnr1b的基因具有，与seq id no:2所示的核酸序列具有85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的核苷酸序列。

9、根据一些实施方式，所述基因具有一个或多个碱基突变。根据具体的实施方式，所述基因在如seq id no:2所示的核酸序列的第722位腺嘌呤可突变为鸟嘌呤(a722g)。

10、根据一些实施方式，所述基因编码猪褪黑素受体mtnr1b的完整的编码序列(cds)。

11、根据又一方面，提供了一种表达载体，其包括如本公开所述的基因。

12、根据一些实施方式，所述表达载体包括编码猪(sus scrofa)褪黑素受体mtnr1b的基因。根据一些实施方式，所述表达载体包括如seq id no:2所示的核酸序列。

13、根据一些实施方式，所述表达载体包括在严格条件下与如seq id no:2所示的核酸序列杂交的核酸序列。

14、根据一些实施方式，所述表达载体包括与seq id no:2所示的核酸序列具有85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性的核苷酸序列。

15、根据一些实施方式，在所述表达载体中，在其转录起始的核苷酸前可添加有任何一种增强型启动子或组成型启动子。根据一些实施方式，所述表达载体还可包括增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

16、根据本公开的又一方面，提供了一种宿主细胞，其表达猪mtnr1b基因。

17、根据一些实施方式，所述宿主细胞包括上述表达载体。

18、根据一些实施方式，所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。根据具体的实施方式，所述宿主细胞可以包括，但并不限于，大肠杆菌(e.coli)、酵母细胞、pk-15细胞、猪胎儿成纤维细胞系、猪卵巢颗粒细胞系、猪子宫内膜细胞系、猪睾丸间质细胞/支持细胞系和猪外周血单核巨噬细胞系等。

19、根据本公开的又一方面，提供了一种引物组，其用于扩增本公开的上述猪mtnr1b基因。

20、根据一些实施方式，所述引物组包括tm差异＜1℃的一对引物。根据一些实施方式，所述引物组包括：如seq id no:4所示的核酸序列；和，如seq id no:5所示的核酸序列。

21、根据本公开的又一方面，提供了用于扩增本公开的上述猪mtnr1b基因的方法。

22、根据一些实施方式，所述方法包括：利用touch-down pcr，对所述猪mtnr1b基因进行扩增。

23、根据一些具体的实施方式，所述touch-down pcr包括：98℃预变性2min；98℃10s，68℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，67℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，66℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，65℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，64℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，63℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，62℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，61℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，60℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，59℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，58℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，57℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，56℃15s，68℃66s，2个循环；98℃10s，55℃15s，68℃66s，10个循环；循环结束后72℃保持10min。

24、根据本公开的又一方面，本公开的猪褪黑素受体mtnr1b或其编码基因在调控猪的褪黑素信号转导中的应用。

25、根据一些实施方式，本公开的猪褪黑素受体mtnr1b或其编码基因在调控猪的免疫力、生殖激素分泌、睾丸发育、卵泡发育、胚胎发育、胚胎附植或发情周期中的应用。

26、本发明首次成功分离出了猪褪黑素受体mtnr1b基因的完整cds，可以在畜牧业中用于调控猪的免疫力、生殖激素分泌、睾丸发育、卵泡发育、胚胎发育、胚胎附植或发情周期，从而促进养猪业的健康发展和猪肉的稳定供应。