CD70基因人源化非人动物的构建方法及应用与流程

cd70基因人源化非人动物的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种cd70基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.cd70是肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员之一，是一种ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞及树突状细胞。cd70及其受体cd27相互作用可以促进t细胞、b细胞及nk细胞的活化、增殖与分化，是免疫应答产生的必要条件。在细胞免疫中，cd70/cd27的主要生物学作用是促进激活t细胞并促其增殖，使其成为效应t细胞及记忆t细胞；在体液免疫中，cd70/cd27的主要作用是促进b细胞分化以及浆细胞的增殖；对于nk细胞来说，cd27与nk细胞表面的cd70直接作用可以增加nk细胞杀伤活性、促进nk细胞分化并释放ifn-γ。
3.生理状态下，cd70被抗体、抗原、细胞因子等高度精确地调控表达，因此其在活化的t细胞和b细胞表面表达的时间较短。除了表达于正常的淋巴细胞，cd70也高表达于多种肿瘤细胞表面，尤其是血源性肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病以及华氏巨球蛋白血症(waldenstroms macroglobulinemia)，是部分肿瘤靶向和免疫治疗的潜在靶点；在非血源性肿瘤中，最早在未分化的鼻咽癌以及生殖细胞癌发现cd70的高表达，后续的研究发现cd70在胸腺瘤、肾母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤以及卵巢癌等肿瘤中也发生高表达，其中尤以肾癌为著，目前已被认为是肾癌的新型特异性肿瘤标志物。此外，研究发现cd27/cd70相互作用提供的共刺激信号在多种自身免疫性疾病的发生、发展中发挥着促进作用，选择性干预该共刺激通路能缓解或减轻某些自身免疫性疾病的发展。例如系统性红斑狼疮(sle)、类风湿性关节炎(ra)等，可能成为自身免疫性疾病的一个特异性治疗靶标。
4.目前，已经有靶向cd70的单克隆抗体进入人体临床，并表现出较好的安全性和治疗效果。例如janssen以3亿美元前期付款、2亿美元股权投资获得的人源化单抗cusatuzumab，其在一项cd70阳性晚期皮肤t细胞淋巴瘤i/ii期临床试验中，不但展现出了良好的安全性和耐受性，还体现了一定的抗癌效果，彰显了其治疗该疾病的潜力；在另一项急性骨髓性白血病i/ii期临床试验中，与azacitidine单独使用的历史数据相比，cusatuzumab与azacitidine联合使用有更高的总缓解率。
5.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。因此，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
6.鉴于cd27/cd70信号通路在肿瘤及自身免疫性疾病等治疗领域的巨大应用潜力，
为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发cd27/cd70信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

7.本技术用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，建立了更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。
8.本发明的第一方面，提供了一种人源化cd70蛋白，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70蛋白的全部或部分。
9.优选的，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70蛋白胞外区、跨膜区和/或胞质区。
10.优选的，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70蛋白的胞外区的全部或部分。进一步优选包含人cd70的胞外区的至少50个到至少154个，例如50、80、100、120、130、140、145、146、147、150或154个连续的氨基酸。进一步优选包含人cd70的胞外区的c端和/或n端去除0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸的胞外区。
11.优选的，所述的人源化cd70蛋白还包含非人动物cd70蛋白的部分，进一步优选的，非人动物cd70蛋白的部分包括非人动物cd70蛋白的跨膜区和/或胞质区；更进一步优选的，还包含非人动物cd70蛋白的部分胞外区，再优选包含非人动物胞外区的c端和/或n端的连续0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸序列。
12.优选的，所述的人cd70蛋白的部分和非人动物cd70蛋白的部分直接连接或间接连接(例如肽接头)。
13.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70蛋白胞外区、非人动物的跨膜区和胞质区，优选还包括非人动物部分胞外区。
14.优选的，所述的人cd70蛋白的部分包含seq id no：2第48-193或39-193位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：2第48-193或39-193位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：2第48-193或39-193位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：2第48-193或39-193位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
15.优选的，所述的非人动物cd70蛋白的部分包含seq id no：1第1-44或1-49位所示氨基酸序列；或者，包含与seq id no：1的第1-44或1-49位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：1第1-44或1-49位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、
5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与seq id no：1第1-44或1-49位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
16.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd70蛋白包含seq id no：2第48-193或39-193位所示氨基酸序列以及seq id no：1第1-44或1-49位所示氨基酸序列。
17.优选的，所述的人cd70蛋白的部分包含人cd70基因编码的全部或部分氨基酸序列。
18.优选的，所述的人cd70蛋白的部分包含人cd70基因的1号外显子、2号外显子和/或3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分；优选的，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70基因的1号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70基因的1号至3号外显子中的一种、两种、三种或连续两种外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化cd70蛋白包含人cd70基因的1号外显子的部分、2号至3号外显子编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分优选为编码跨膜区和/或胞外区的核苷酸序列。
19.优选的，所述的非人动物cd70蛋白的部分包含非人动物cd70基因编码的部分氨基酸序列。优选为非人动物cd70基因的1号外显子编码的部分氨基酸序列。
20.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd70蛋白包含非人动物cd70基因1号外显子的部分、人cd70基因的2号至3号外显子的全部编码的氨基酸序列，优选还包含人cd70基因的1号外显子编码的部分氨基酸序列。
21.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
22.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
23.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
24.优选的，所述人源化cd70蛋白中来源于人cd70蛋白的氨基酸序列与seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
25.优选的，所述人源化cd70蛋白中来源于非人动物cd70蛋白的氨基酸序列与seq id no：1所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。
26.优选的，所述人源化cd70蛋白包含至少50个氨基酸序列与人cd70的相应氨基酸序列相同，进一步的，所述的50个氨基酸序列是从c端第一个氨基酸起的氨基酸序列。
27.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd70蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
28.a)为seq id no：11氨基酸序列的全部或部分；
29.b)与seq id no：11氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
30.c)与seq id no：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或
31.d)与seq id no：11所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
32.本发明的第二方面，提供了一种编码所述人源化cd70蛋白的核酸。
33.本发明的第三方面，提供了一种人源化cd70基因，所述的人源化cd70基因包含人cd70基因的部分。
34.优选的，所述的人源化cd70基因编码所述的人源化cd70蛋白。
35.优选的，所述的人源化cd70基因包含人cd70基因的1号至3号外显子的全部或部分，进一步优选包含人cd70基因的1号至3号外显子中的任一种、两种或三种或连续两种的外显子，更进一步优选包含人cd70基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1号外显子的至少10bp到至少310bp，例如10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、50、100、150、200、250、300、310bp的连续核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含3号外显子的至少100bp到至少567bp，例如100、200、300、350、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、500、550、567bp的连续核苷酸序列，优选还包含1-2号内含子和/或2-3号内含子。
36.优选的，所述的人源化cd70基因包含人cd70基因的全部或部分的基因组dna序列、cdna序列或cds序列。
37.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd70基因包含的人cd70基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：
38.(a)seq id no：5所示核苷酸序列的全部或部分；
39.(b)与seq id no：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
40.(c)与seq id no：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
41.(d)具有seq id no：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
42.优选的，所述的人源化cd70基因还包含非人动物cd70基因的部分，进一步优选包含非人动物cd70基因的1号外显子的全部或部分，和/或3号外显子的全部或部分。
43.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化cd70基因包含非人动物cd70的1号外显子的部分、人cd70基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的部分以及非人动物cd70基因的3号外显子的部分。优选还包含人cd70基因的1-2号内含子和/或2-3号内含子。
44.优选的，所述的人源化cd70基因包含编码人cd70蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化cd70基因包含编码人cd70蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。
45.优选的，所述的人源化cd70基因包含编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列
system/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
61.本发明的第四方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：
62.a)编码人或人源化cd70蛋白的核苷酸序列的全部或部分；
63.b)编码人cd70蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列，优选编码人cd70蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人cd70的胞外区的至少50个到至少154个，例如50、80、100、120、130、140、145、146、147、150或154个连续的氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码人cd70的胞外区的c端和/或n端去除0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸的胞外区的核苷酸序列，更优选编码包含seq id no：2第39-193或48-193位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，编码包含与seq id no：2第39-193或48-193位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
64.c)人或人源化cd70基因的全部或部分；或，
65.d)人cd70基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选人cd70基因的1号至3号外显子中的任一个、两个或三个或两个连续外显子，进一步优选人cd70基因的1号外显子的部分，2号外显子的全部和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1号外显子的至少10bp到至少310bp，例如10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、50、100、150、200、250、300、310bp的连续核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含3号外显子的至少100bp到至少567bp，例如100、200、300、350、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、500、550、567bp的连续核苷酸序列，优选还包含1-2号内含子和/或2-3号内含子；更进一步优选包含seq id no：5所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
66.优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
67.所述的5’臂(或5’同源臂)与待改变的转换区5’端同源的dna片段，其选自非人动物cd70基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000083.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：3具有90％同源性，或者如seq id no：3所示。
68.所述的3’臂(或3’同源臂)与待改变的转换区3’端同源的dna片段，其选自非人动物cd70基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000083.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：4具有90％同源性，或者如seq id no：4所示。
69.优选的，所述的靶向载体还包含非人动物3’utr。
70.优选的，所述的靶向载体还包含非人动物5’utr。
71.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物cd70基因座。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物cd70基因1号至3号外显子上。进一步优选的，位于非人动物cd70基因的1号和/或3号外显子上。
72.优选的，所述的靶向载体包含与seq id no：6和/或seq id no：7具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或者包含seq id no：6和/或seq id no：7所示的核苷酸序列。
73.优选的，所述的靶向载体包含与seq id no：8和/或seq id no：9具有至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或者包含seq id no：8和/或seq id no：9所示的核苷酸序列。
74.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
75.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
76.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
77.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
78.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
79.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
80.本发明的第五方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
81.本发明的第六方面，提供了上述靶向载体、包含上述靶向载体的细胞在cd70基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。
82.本发明的第七方面，提供了一种cd70基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化cd70蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化cd70基因。
83.优选的，所述的人源化cd70蛋白为上述的人源化cd70蛋白。
84.优选的，所述的人源化cd70基因为上述的人源化cd70基因。
85.优选的，所述的非人动物的内源cd70蛋白表达降低或缺失。
86.优选的，所述的非人动物的基因组中包含人cd70基因的部分，进一步优选包含人cd70基因的1号至3号外显子的全部或部分，更进一步优选包含人cd70基因的1号至3号外显子中的任一种、两种或三种或连续两种的外显子，再进一步优选包含人cd70基因的1号外显
子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，，其中，1号外显子的部分至少包含1号外显子的至少10bp到至少310bp，例如10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、50、100、150、200、250、300、310bp的连续核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含3号外显子的至少100bp到至少567bp，例如100、200、300、350、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、500、550、567bp的连续核苷酸序列，优选还包含1-2号内含子和/或2-3号内含子；更进一步优选包含seq id no：5所示核苷酸序列；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与seq id no：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有seq id no：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
87.优选的，所述的非人动物基因组中包含编码人cd70蛋白的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人cd70蛋白的胞外区、胞质区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，更进一步优选包含编码人cd70蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，人cd70蛋白胞外区的部分包括人cd70的胞外区的至少50个到至少154个，例如50、80、100、120、130、140、145、146、147、150或154个连续的氨基酸。进一步优选包含人cd70的胞外区的c端和/或n端去除0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸的胞外区。
88.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物基因组中包含编码seq id no：2第39-193或48-193位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与seq id no：2第39-193或48-193位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
89.优选的，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物cd70基因座上：
90.a)编码人或人源化cd70蛋白的核苷酸序列的全部或部分；
91.b)编码人cd70蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列，优选编码人cd70蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码人cd70的胞外区的至少50个到至少154个，例如50、80、100、120、130、140、145、146、147、150或154个连续的氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选包含编码人cd70的胞外区的c端和/或n端去除0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个氨基酸的胞外区的核苷酸序列，更优选编码包含seq id no：2第39-193或48-193位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，编码包含与seq id no：2第39-193或48-193位所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码seq id no：2第39-193位或者第48-193位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
no：1第45-195位氨基酸的核苷酸序列。
103.优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化cd70基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物cd70基因座上。优选的，所述的构建方法包括用包含人cd70基因的部分插入或替换非人动物cd70基因座上内源cd70基因的部分。优选的，所述的构建方法包括用包含人cd70基因的1号至3号外显子的全部或部分插入或替换非人动物cd70基因的1号至3号外显子的全部或部分。优选的，所述的构建方法包括用包含人cd70基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的部分插入或替换非人动物cd70基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，优选的1-2号内含子和/或2-3号内含子被替换。
104.优选的，所述的构建方法包括修饰非人动物cd70基因的编码框，将包含如上所述的任一核苷酸序列插入非人动物cd70基因内源调控元件之后，其中，所述的修饰非人动物cd70基因的编码框可以采用敲除非人动物cd70基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物cd70蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能，进一步优选的，所述的修饰非人动物cd70基因的编码框可以为敲除非人动物cd70基因的外显子1至外显子3的全部或部分核苷酸序列。优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源cd70基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源cd70基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
105.优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化cd70基因。
106.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化cd70蛋白。
107.优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、crispr/cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
108.优选的，使用本发明所述的靶向载体进行非人动物的构建。
109.优选的，所述的构建方法包括将所述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得cd70基因人源化的非人动物。
110.优选的，所述的构建方法进一步包括将cd70基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
111.优选的，所述的其他基因选自pd-1、pd-l1、cd27、cd40、ox40、4-1bb、lag3中的至少一种。优选的，人或人源化cd70基因或其他基因对于内源被修饰的基因座是纯合的；优选的，人或人源化cd70基因或其他基因对于内源被修饰的基因座是杂合的。
112.本发明的第八方面，提供了一种人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化cd70蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化cd70基因。
113.优选的，所述的人源化cd70蛋白为上述的人源化cd70蛋白。
114.优选的，所述的人源化cd70基因为上述的人源化cd70基因。
115.优选的，编码所述人或人源化cd70蛋白的核苷酸序列或者所述人或人源化cd70基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性cd70基因座处的内源性调控元件。
116.优选的，所述的非人动物的内源cd70蛋白表达降低或缺失。
117.优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自pd-1、pd-l1、cd27、cd40、ox40、4-1bb、lag3中的至少一种。
118.优选的，人或人源化cd70基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的。
119.优选的，人或人源化cd70基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。
120.本发明的第九方面，提供了一种cd70基因缺失的非人动物。
121.优选的，所述的非人动物缺失cd70基因的全部或部分核苷酸序列。
122.优选的，所述的非人动物缺失了cd70基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失1号至3号外显子中的一种、两种、三种或连续两种外显子的组合的核苷酸序列的全部或部分。更进一步优选的，缺失了1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分核苷酸序列。最为优选的，缺失了1号外显子的部分、1-2内含子、2号外显子的全部、2-3内含子和3号外显子的部分核苷酸序列。
123.优选的，所述的非人动物缺失了的cd70基因1号外显子的部分至少不包含非编码区，进一步优选的，还不包含编码胞质区和/或跨膜区的部分。更进一步优选的，所述的非人动物还缺失了的cd70基因1号外显子上编码部分胞外区的核苷酸序列。
124.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失了的内源cd70基因3号外显子的部分核苷酸序列至少不包含非编码区。
125.优选的，所述的非人动物缺失了编码胞质区、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的非人动物缺失了编码胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失了编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。
126.本发明的第十方面，提供了一种上述cd70基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用所述的靶向载体进行非人动物的构建。
127.本发明的第十一方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
128.i)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；
129.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
130.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因pd-1、pd-l1、cd27、cd40、ox40、4-1bb和/或lag3修饰的非人动物。
131.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因修饰的非人动物。
132.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座均可以是纯合的。
133.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座均可以是杂合的。
134.本发明的第十二方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代。
135.本发明的第十三方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。
136.本发明的第十四方面，提供了一种动物模型的制备方法，所述的制备方法包括利用上述构建的cd70基因人源化的非人动物、cd70基因缺失的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代进行的。优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
137.本发明的第十五方面，提供了上述的cd70基因人源化的非人动物、cd70基因缺失的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代、或者上述的构建方法获得的cd70基因人源化的非人动物、cd70基因缺失的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物模型中的应用。
138.本发明的第十六方面，提供了一种所述的细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达所述的人源化cd70蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含上述的人源化cd70基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，来源于上述的构建方法获得的非人动物。
139.本发明的第十七方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化cd70蛋白，或者，所述的瘤组织的基因组中包含上述的人源化cd70基因，或者，所述的瘤组织来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物，或者上述的动物模型。
140.本发明的第十八方面，提供了一种cd70基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化cd70蛋白，或者，所述的细胞的基因组中包含人源化cd70基因。
141.优选的，所述的人源化cd70蛋白为本发明第一方面所述的人源化cd70蛋白。
142.优选的，所述细胞中内源cd70蛋白表达降低或缺失。
143.优选的，所述的细胞的基因组中包含人cd70基因的全部或部分。进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化cd70基因。
144.本发明的第十九方面，提供了来源于上述的人源化cd70蛋白、上述的人源化cd70基因、上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型、上述的细胞、组织或器官、上述的荷瘤后的瘤组织的应用，所述的应用包含：
145.(a)涉及人类细胞的与cd70相关的免疫过程的产品开发中的应用；
146.(b)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与cd70相关的模型系统中的应用；
147.(c)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与cd70相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；
148.(d)在体内研究人cd70信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，
149.(e)研究cd70基因功能，研究针对人cd70靶位点的药物、药效，研究与cd70相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用；
150.(f)研究cd27/cd70信号通路在肿瘤及免疫相关疾病等治疗领域的应用。
151.优选的，所述的应用可以为治疗目的。
152.优选的，所述的应用可以为非治疗目的。
153.本发明的第二十方面，提供了一种人cd70特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、或者上述的动物模型。
154.优选的，所述的调节剂选自car-t、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。
155.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
156.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
157.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
158.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
159.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
160.优选的，所述人cd70特异性调节剂的筛选方法可以为治疗目的。
161.优选的，所述人cd70特异性调节剂的筛选方法可以为非治疗目的。该筛选方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
162.本发明的第二十一方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。
163.优选的，所述的干预方案选自car-t、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗原结合蛋白为抗体。
164.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
165.优选的，所述干预方案的评价方法可以为治疗目的。
166.优选的，所述干预方案的评价方法可以为非治疗目的。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
167.本发明的第二十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型在制备人cd70特异性调节剂中的用途。
168.本发明的第二十三方面，提供了一种来源于上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或免疫相关疾病的药物中的用途。
169.本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
170.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
171.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
172.本发明所述的cd70基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化cd70蛋白，可用于针对人cd70靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究cd70蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
173.本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞、胚胎干细胞、免疫细胞(例如t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞及树突状细胞)、肿瘤细胞等。所述的肿瘤细胞可以为血源性肿瘤，例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病以及华氏巨球蛋白血症，还可以为胸腺瘤、肾母细胞瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤以及卵巢癌等。因此，根据细胞来源的不同，本技术所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。
174.本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
175.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
176.本发明所述的“人源化cd70蛋白”，包含来源于人cd70蛋白的部分和非人cd70蛋白的部分。其中，所述的“人cd70蛋白”同人cd70蛋白的全部，即其氨基酸序列与人cd70蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人cd70蛋白的部分”，为连续或间隔的5-193个氨基酸序列与人cd70蛋白的氨基酸序列一致。优选为连续或间隔10-146个，例如连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、146、150、160、170、180、190、193个氨基酸序列与人cd70蛋白的氨基酸序列一致。
177.本发明所述的“人cd70蛋白的跨膜区的全部”、“人cd70蛋白的胞质区的全部”或“人cd70蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人cd70蛋白的跨膜区、胞质区或胞外区的全长氨基酸序列一致。
178.本发明所述的“人cd70蛋白的胞外区的部分”，为连续或间隔5-155(优选为10-146)个氨基酸序列与人cd70蛋白的胞外区氨基酸序列一致，例如连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、146、150、155个氨基酸序列与人cd70蛋白的胞外区氨基酸序列一致。
179.本发明所述的“非人动物cd70蛋白的部分”，为连续或间隔5-195(优选为10-50个)
个氨基酸序列与非人动物cd70蛋白的氨基酸序列一致，例如连续5、10、20、30、40、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、195个氨基酸序列与非人动物cd70蛋白的氨基酸序列一致。
180.本发明所述的“人源化cd70基因”，包含来源于人cd70基因的部分和非人cd70基因的部分。其中，所述的“人cd70基因”同人cd70基因的全部，即其核苷酸序列与人cd70基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人cd70基因的部分”为连续或间隔的20-9503bp(优选20-4842bp或20-911或20-441)个核苷酸序列与人cd70基因的核苷酸序列一致，例如20、50、100、200、300、400、441、500、600、700、800、900、911、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、4000、4842、5000、6000、7000、8000、9000或9503bp个核苷酸序列与人cd70基因的核苷酸序列一致。
181.本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人cd70基因的1号外显子的部分，包含连续或间隔的5-310bp(优选10-21bp)核苷酸序列与人cd70基因的1号外显子核苷酸序列一致。例如人cd70基因的3号外显子的部分，包含连续或间隔的5-567bp(优选10-386bp)核苷酸序列与人cd70基因的3号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人cd70基因”中包含的“1号外显子的部分”至少包括从编码人胞外区的第48位氨基酸的核苷酸序列开始至1号外显子的最后一个核苷酸序列为止。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化cd70基因”中包含的“3号外显子的部分”至少包括从3号外显子的第一个核苷酸序列开始至终止密码子为止。
182.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至3号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子和3号外显子的全部核苷酸序列。
183.本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。
184.本发明所述的“非人动物cd70基因的部分”为连续或间隔20-3781bp(20-764bp或20-441bp)个核苷酸序列与非人动物cd70基因的核苷酸序列一致，例如连续20、50、100、200、300、400、441、500、600、700、764、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3781个核苷酸序列与非人动物cd70基因的核苷酸序列一致。
185.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“cd70基因座”表示cd70基因1号至3号外显子上的任选一段的dna片段。
186.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
187.本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗
干预。
188.本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
189.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
190.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecular cloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotide synthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，ed.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
191.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，
所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
192.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠及nod、nod/scid、nod-prkdc
scid il-2rg
null
背景的小鼠。
193.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
194.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
195.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
196.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
197.图1：小鼠cd70基因和人cd70基因座对比示意图(非按比例)；
198.图2：小鼠cd70基因人源化改造示意图(非按比例)；
199.图3：cd70基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；
200.图4：southern blot检测结果，其中wt为野生型对照；
201.图5：cd70基因人源化小鼠frt重组过程示意图(非按比例)；
202.图6：f1代小鼠基因型鉴定结果，其中m为marker，wt为野生型对照，pc为阳性对照，h2o为水对照；
203.图7：小鼠胸腺组织rt-pcr检测结果，其中m为marker，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为cd70基因人源化纯合子小鼠，h2o为水对照。
具体实施方式
204.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
205.在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
206.bglii、draiii、asei酶购自neb，货号分别为r0144m、r0510l、r0526m；
207.c57bl/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
208.brilliant violet 510
tm
anti-mouse cd45 antibody购自biolegend，货号103138；
209.percp/cy5.5 anti-mouse tcrβchain购自biolegend，货号109228；
210.brilliant violet 605
tm
anti-mouse cd11c antibody购自biolegend，货号117334；
211.apc anti-mouse cd70 antibody购自biolegend，货号2204066；
212.pe anti-human cd70 antibody购自biolegend，货号355103；
213.zombie nir
tm
fixable viability kit购自biolegend，货号423106；
214.purified anti-mouse cd16/32购自biolegend，货号101302。
215.实施例1 cd70基因人源化小鼠的制备
216.小鼠cd70基因(ncbi gene id：21948，primary source：mgi：1195273，uniprot：o55237，位于17号染色体nc_000083.7的第57452997至57456777位，基于转录本nm_011617.2及其编码蛋白np_035747.1(seq id no：1))和人cd70基因(ncbi gene id：970，primary source：hgnc：11937，uniprot id：p32970，位于19号染色体nc_000019.10的第6581648至6591150位，基于转录本nm_001252.5及其编码蛋白np_001243.1(seq id no：2))对比示意图如图1所示。
217.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源cd70基因座引入编码人cd70蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化cd70蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠cd70基因调节元件的控制下，用编码人cd70蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化cd70基因座示意图如图2所示，实现对小鼠cd70基因的人源化改造。
218.进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠cd70基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人cd70蛋白的核苷酸序列的a片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：3)与ncbi登录号为nc_000083.7的第57456455至57460839位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：4)与ncbi登录号为nc_000083.7的第57448179至57452246位核苷酸序列相同；a片段上包含的人cd70基因序列(seq id no：5)与ncbi登录号为nc_000019.10的第6586020至6590861位核苷酸序列相同；a片段中人cd70序列上游与小鼠的连接设计为片段中人cd70序列上游与小鼠的连接设计为其中序列“aacag”中的“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列中的第一个“c”是人的第一个核苷酸；人cd70序列下游与小鼠的连接设计为其中序列“cctga”中的“a”是人的最后一个核苷酸，序列中的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。
219.靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassette)。其中neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为连接设计为其中序列“cgcag”中的最后一个“g”是小鼠的最后一个核苷酸，序列中的第一个“c”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为其中序列“gccgc”中的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列中的第一个“t”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因
(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。改造后的人源化小鼠cd70的mrna序列如seq id no：10所示，表达的蛋白序列如seq id no：11所示。
220.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经pcr鉴定为阳性的克隆再进行southern blot(分别用bglii或draiii或asei消化细胞dna并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，示例性结果如图4所示，经测序进一步验证发现，编号为1-a11、1-g02、1-g12和3-e06的4个克隆为阳性克隆且无随机插入。
221.表1：具体探针及目的片段长度
222.限制性内切酶探针野生型片段大小重组序列片段大小bglii5’probe8.4kb5.8kbdraiii3’probe20.7kb12.1kbaseineo probe-10.4kb
223.其中，pcr测定包括下述引物：
224.pcr-f1：5
’‑
cactgccacggaattcttgaggtga-3’(seq id no：12)，
225.pcr-r1：5
’‑
tcattctgtcttttcggtcacgcg-3’(seq id no：13)；
226.pcr-f2：5
’‑
gctcgactagagcttgcgga-3’(seq id no：14)，
227.pcr-r2：5
’‑
acagtctggacctccgaggca-3’(seq id no：15)；
228.southern blot检测包括如下探针引物：
[0229]5’
probe：
[0230]5’
probe-f：5
’‑
agaagcaacttgcagaagggacagg-3’(seq id no：16)，
[0231]5’
probe-r：5
’‑
tttagaggccctcggagattggtct-3’(seq id no：17)；
[0232]3’
probe：
[0233]3’
probe-f：5
’‑
tctcctctctctttgttggctctgg-3’(seq id no：18)，
[0234]3’
probe-r：5
’‑
aaggccttctagcacaggatctcca-3’(seq id no：19)；
[0235]
neo probe：
[0236]
neo probe-f：5
’‑
ggatcggccattgaacaagat-3’(seq id no：20)，
[0237]
neo probe-r：5
’‑
cagaagaactcgtcaagaaggc-3’(seq id no：21)。
[0238]
将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到cd70基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为f1-01、f1-02、f1-03、f1-04、f1-05、f1-06、f1-07、f1-08的8只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的cd70基因人源化小鼠。
[0239]
表2：引物名称及具体序列
[0240][0241]
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化cd70 mrna的表达情况，例如rt-pcr等。具体来说，分别选取9周龄野生型c57bl/6小鼠和本方法制备的10周龄cd70基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取胸腺组织，设计如表3所示引物序列对c57bl/6小鼠和cd70基因人源化纯合子小鼠胸腺组织的mrna表达情况进行检测。结果显示，在c57bl/6小鼠胸腺组织中仅检测到鼠cd70mrna的表达(图7a)；在cd70基因人源化纯合子小鼠胸腺组织中只检测到人源化cd70 mrna的表达(图7b)，未检测到鼠cd70 mrna的表达(图7a)。
[0242]
表3：rt-pcr引物序列
[0243][0244]
可通过流式细胞术确认阳性小鼠体内人源化cd70蛋白的表达情况。具体来说，分别选取8周龄野生型c57bl/6雌性小鼠和本实施例制备的9周龄cd70基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取骨髓细胞，用1ug/ml脂多糖(lps)刺激培养24h后，分别使用抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm
anti-mouse cd45 antibody(mcd45)、鼠特异性t细胞表面抗体percp/cy5.5 anti-mouse tcrβchain(mtcrβ)、抗鼠cd11c抗体brilliant violet 605
tm
anti-mouse cd11c antibody(mcd11c)、抗鼠cd70抗体apc anti-mouse cd70 antibody(mcd70)或抗人cd70抗体pe anti-human cd70 antibody(hcd70)识别染色后进行流式检测，结果显示，野生型c57bl/6小鼠骨髓中树突状细胞(dc)(特征为mcd45+mtcrβ-mcd11c+)中mcd70标记细胞(特征为mcd45+mtcrβ-mcd11c+mcd70+)的占比为14.1％，hcd70(特征为mcd45+mtcrβ-mcd11c+hcd70+)标记细胞占比为0.95％；而在cd70基因人源化小鼠骨髓dc细胞中hcd70标记细胞的占比为20.1％，mcd70标记细胞的占比为0.94％。上述结果表明，cd70基因人源化小鼠骨髓细胞中能够成功表达人源化cd70蛋白。
[0245]
实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
[0246]
利用本方法或制得的cd70基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有pd-1、pd-l1、
cd27、cd40、ox40、4-1bb、lag3等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化cd70小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得cd70与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的cd70小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化cd70与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人cd70和其它基因调节剂的体内药效验证等。
[0247]
实施例3药效验证
[0248]
利用本方法制得的cd70基因人源化小鼠或多基因修饰的小鼠可以用于评估靶向人cd70抗体的药效。例如，取cd70基因人源化纯合子小鼠构建肿瘤动物模型，将小鼠分为对照组或治疗组，治疗组注射靶向人cd70的抗体药物，对照组注射等体积的生理盐水。然后对各组小鼠的体重、肿瘤体积和肿瘤相关指标进行监测，可有效评估抗体药物在人源化cd70小鼠体内的安全性和体内药效。
[0249]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。