鱼类嗅觉神经元的培养方法

1.本发明涉及神经元培养领域，具体涉及一种鱼类嗅觉神经元的培养方法。


背景技术：

2.嗅觉是鱼类最重要的感觉系统之一，对鱼类生命活动至关重要，可识别与繁殖、摄食、避敌等相关的气味分子，形成复杂的嗅觉感知。嗅囊是鱼类重要的感觉器官，主要由嗅觉神经元、基底细胞和支持细胞组成，嗅觉神经元约占70～85％。嗅觉受体基因(ors)在嗅觉神经元中表达，一个嗅觉神经元只表达一种or。脊椎动物强大的嗅觉功能依赖于嗅觉神经元的多样性和or表达的精确性，因此建立鱼类体外嗅觉神经元培养体系对深入研究鱼类的嗅觉识别机制及嗅觉受体基因功能至关重要。
3.最初对嗅觉神经元的培养仅限于器官培养，但器官培养不能直接观察神经细胞突起的生长情况，不便进行单个细胞电生理活动的检测和相关实验研究。而利用胰蛋白酶消化法和组织块培养法获得的单个嗅觉神经元具有急性分离的嗅神经细胞的特性，有助于从细胞层面开展体外研究。但所用的含血清培养基有益于非神经细胞的生长，尤其是纤维细胞，例如酶消化法在培养第4～5d时血清帮助纤维细胞快速增殖，使其占据绝对优势，影响嗅觉神经元的正常生长，此外，传统的酶消化对嗅觉神经元伤害较大，使其培养的嗅觉神经元突触生长较慢、轴突较短；而组织块法在培养3d时从组织块周围爬出大量铺路石状细胞，随后仅有少量神经形态细胞出现，且组织块法培养的嗅觉神经元纯度较低，细胞类型较多，不利于进行后续嗅觉神经元实验。
4.目前有研究表明，在哺乳动物中利用添加神经营养因子的无血清培养基更适合离体嗅觉神经元的生长，能培养出具有较小的双极神经元、体积较大的多极神经元和锥形神经元等多种形态的嗅觉神经元体系。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鱼类嗅觉神经元的培养方法。团头鲂是我国优良的淡水草食性经济鱼类，本发明从细胞消化方法和细胞培养基两个方面进行改善，建立鱼类嗅觉神经元体外培养体系，便于在体外研究团头鲂嗅觉神经元的功能，也为在单细胞水平深入探究鱼类嗅觉识别机制及ors功能奠定基础。
6.为实现上述目的，本发明所设计的一种鱼类嗅觉神经元的培养方法，包括以下步骤：
7.1)取团头鲂嗅囊组织置于pbs缓冲液中，剥离嗅囊边缘黏膜，重复清洗，得到嗅囊组织；
8.2)向嗅囊组织中加入aim消毒液，密封后置于冰上消毒(置于冰上消毒提高细胞的存活率)，离心、弃上清，得到沉淀组织；
9.3)向沉淀组织中加入胰蛋白酶-edta消化液(含有0.25％胰酶和0.02％edta)消化，用中和培养基终止消化、离心、弃上清；
10.4)加入胶原酶工作液，缓慢吹打消化，用中和培养基终止消化，离心收集细胞上清液；将细胞上清液置于冰上；
11.5)重复步骤4)三次及以上；
12.6)将收集的细胞上清液用细胞筛过滤，离心、收集细胞沉淀，用中和培养基清洗多次，离心弃上清，加入生长培养基重悬浮，得到细胞悬液；
13.7)将细胞悬液接种于六孔板中，密封后置于细胞培养箱中培养，后弃生长培养基，加入神经细胞培养基继续培养5～7d，得到鱼类嗅觉神经元，期间每3d换液一次。
14.进一步地，所述步骤2)中，aim消毒液由以下方法制备而成：
15.在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、2.5ml两性霉素b、0.5ml硫酸庆大霉素加入50ml无菌离心管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后，封装后于4℃冰箱保存备用。
16.再进一步地，所述步骤4)中，胶原酶工作液由以下方法制备而成：
17.在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、0.5ml硫酸庆大霉素、0.5ml dnaseⅰ(20u/ml)、2ml胶原酶ⅰ+ⅳ母液加入50ml无菌离心管内，加dmem/f12培养基至46ml，0.22μm过滤器过滤后，转移至新的无菌管内，再加4ml胰蛋白酶-edta消化液，封装后于4℃冰箱保存备用。
18.再进一步地，所述胶原酶ⅰ+ⅳ母液由以下方法制备而成：
19.在超净工作台内，将100mg胶原酶ⅰ和100mg胶原酶ⅳ溶于40ml pbs溶液中，0.22μm过滤器过滤后分装2ml/管，于-20℃保存备用。
20.再进一步地，所述步骤2)和步骤3)中，离心转速为500r/min、时间为1min；
21.所述步骤3)中，胶原酶工作液消化时间为6min。
22.再进一步地，所述步骤3)和步骤4)中，中和培养基由以下方法制备而成：
23.在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、2.5ml两性霉素b、0.25ml硫酸庆大霉素、10ml胎牛血清(fbs)加入50ml无菌离心管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌离心管内，封装后于4℃冰箱保存备用。
24.再进一步地，所述步骤6)中，生长培养基由以下方法制备而成：
25.在超净工作台内，取2ml青链霉素双抗、0.5ml hepes、1ml b-27plus、0.5ml n-2添加剂(n-2supplement)、5ml fbs加入50ml无菌离心管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管，封装后于4℃冰箱保存备用。
26.再进一步地，所述步骤7)中，接种密度为1
×
106个细胞。
27.再进一步地，所述步骤7)中，细胞培养箱条件为：温度为27℃、co2浓度为5％，培养时间为24～48h。
28.再进一步地，所述步骤7)中，神经细胞培养基由以下方法制备而成：
29.在超净工作台内，取1ml青链霉素双抗、0.5ml hepes、1ml b-27plus、0.5ml n-2添加剂加入50ml无菌离心管内，最后加neurobasal plus a基础培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管，封装后于4℃冰箱保存备用。
30.本发明的有益效果：
31.1.本发明将胶原酶ⅰ和ⅳ与胰蛋白酶结合，用dmem/f12稀释后消化细胞，减少胰蛋白酶消化对嗅觉神经元的伤害，提高了细胞的存活率；
32.2.本发明选择含血清和不含血清两种培养基相结合的方法进行细胞培养，前期用
含血清培养基帮助嗅觉神经元细胞贴壁，当细胞贴壁完成后使用神经细胞培养基，并且加入n-2添加剂(n-2supplement)和b-27神经细胞添加剂，帮助嗅觉神经细胞的生长。
33.3.本发明基于嗅觉神经元最适贴壁时长，选择接种24～48h时将培养基更换为神经细胞培养基，最终保证了嗅觉神经元的纯度；
34.4.本发明中胶原酶工作液消化时长为6min，得到了较多贴壁性良好的嗅觉神经元；
35.5.本发明使用500r/min离心1min的目的均是为了使离心管中的组织沉淀，防止组织块和细胞液一起被吸出；为了减少细胞上清液中细胞沉淀，可以适当减少转速或时间；
36.6.本发明在胶原酶工作液消化前加入胰蛋白酶-edta消化液(含有0.25％胰酶和0.02％edta)能减少嗅囊边缘黏膜的残留，根据组织情况可适当调整消化时间，但最长不超过5min；
37.7.本发明中加入中和培养基的量是胰蛋白酶-edta消化液和胶原酶工作液的两倍及以上，目的是彻底中和消化液中的消化酶，同时为细胞提供良好的生存环境。
38.8.本发明将实验鱼置于冰中2～3min，防止鼻孔充血，避免嗅囊组织中有较多血液而干扰取样；
39.综上所述：本发明成功地建立了鱼类嗅觉神经元培养体系，其嗅觉神经元突起生长较快，细胞状态良好、纯度较高，具有正常的嗅觉神经元功能；本发明操作简单，重复性好，减少了体外实验的成本和时间。
附图说明
40.图1为本发明制备的嗅觉神经元生长过程在倒置显微镜下分析图；
41.图2为本发明制备的嗅觉神经元dapi、neun和merge分析图。
具体实施方式
42.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
43.一种鱼类嗅觉神经元的培养方法，包括以下步骤：
44.1)取10～12尾9～12月龄团头鲂，剪尾放血后，将其置于冰中2min，用75％酒精喷洒全身消毒，移入超净工作台中，取其嗅囊；
45.2)将其嗅囊置于10ml pbs的培养皿中，用无菌镊子将嗅囊边缘黏膜剥离；把嗅囊移入15ml离心管中，加pbs缓慢晃动，弃含有嗅觉黏膜的pbs，重复两次清洗嗅囊，得到嗅囊组织；
46.3)向嗅囊组织中加入10ml aim消毒液，封口膜密封，置于冰上，消毒杀菌30min，500r/min离心1min，弃上清；
47.4)向沉淀组织中加入3～5ml胰蛋白酶-edta消化液(含有0.25％胰酶和0.02％edta)消化5min，用中和培养基终止消化，500r/min离心1min，弃上清；
48.5)加入5ml胶原酶工作液，缓慢吹打消化6min，加入》10ml中和培养基终止消化，500r/min离心1min，收集细胞上清液于50ml无菌离心管，置于冰上；
49.6)重复步骤5)三次及以上；
50.7)将收集的细胞上清液用100μm的细胞筛过滤，1200r/min离心6min收集于一管中，用中和培养基清洗，1000r/min离心5min，弃上清，重复两次，加入生长培养基重悬浮，得到细胞悬液；
51.8)将细胞悬液接种于六孔板中，接种密度为1
×
106个细胞，用封口膜密封，于27℃、5％co2细胞培养箱中培养24～48h后除去生长培养基，加入神经细胞培养基继续培养5～7d，得到鱼类嗅觉神经元，期间每3d换液一次。
52.上述方法所用试剂和培养基的制备方法如下：
53.aim消毒液：超净工作台内取2ml青链霉素双抗、2.5ml两性霉素b、0.5ml硫酸庆大霉素加入50ml无菌离心管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，盖紧瓶盖；标明培养基名称、配制日期、配制后缠紧封口膜，4℃冰箱保存备用。
54.胶原酶工作液：超净工作台内取2ml青链霉素双抗、0.5ml硫酸庆大霉素、0.5ml dnaseⅰ(20u/ml)、2ml胶原酶ⅰ+ⅳ母液加入50ml无菌离心管内，加dmem/f12培养基至46ml，0.22μm过滤器过滤后，转移至新的无菌管内，再加4ml胰蛋白酶-edta消化液(含有0.25％胰酶和0.02％edta)，盖紧瓶盖；标明培养基名称、配制日期、配制后缠紧封口膜，4℃冰箱保存备用。
55.胶原酶ⅰ+ⅳ母液：在超净工作台内将100mg胶原酶ⅰ和100mg胶原酶ⅳ溶于40ml pbs溶液中，0.22μm过滤器过滤后分装2ml/管，于-20℃保存备用。
56.中和培养基：超净工作台内取2ml青链霉素双抗、2.5ml两性霉素b、0.25ml硫酸庆大霉素、10ml胎牛血清(fbs)加入50ml无菌离心管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，盖紧瓶盖；标明培养基名称、配制日期、配制后缠紧封口膜，4℃冰箱保存备用。
57.生长培养基：超净工作台内取2ml青链霉素双抗、0.5ml hepes、1ml b-27plus、0.5ml n-2添加剂、5ml fbs加入50ml无菌管内，最后加dmem/f12培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管内，盖紧瓶盖；标明培养基名称、配制日期、配制后缠紧封口膜，4℃冰箱保存备用。
58.神经细胞培养基：超净工作台内取1ml青链霉素双抗、0.5ml hepes、1ml b-27plus、0.5ml n-2添加剂加入50ml无菌离心管中，最后加neurobasal plus a基础培养基至50ml，0.22μm过滤器过滤后转移至新的无菌管中，盖紧瓶盖；标明培养基名称、配制日期、配制后缠紧封口膜，4℃冰箱保存备用。
59.如图1可知：细胞接种1d时有部分细胞贴壁，未出现双极神经元细胞形态；3d时有典型的双极细胞形态出现；5d时细胞增殖，细胞密度较高；7d时神经细胞形态最多，细胞密度仍维持在较高水平；9d时部分细胞呈凋亡状态；因此，使用本发明方法可以培养出较多轴突较长、突触阳性刻点数量较多、细胞生长形态较好的嗅觉神经元。
60.如图2可知：细胞生长第6d时，取生长在细胞爬片上的嗅觉神经元进行免疫荧光标记，抗体为神经细胞核蛋白标记物neun抗体(绿色)，其中大量细胞被neun抗体标记，与细胞核标记物dapi(蓝色)进行merge后能清晰看到细胞形态，细胞之间相互连接，神经元纯度可达90％。
61.其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描
述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。