本发明属于基因检测领域，具体涉及一种检测人类家系及孕妇胎儿游离dna的rh血型基因型的引物探针组、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、rh血型系统是临床意义最大、最复杂的血型系统之一。rh血型是红细胞的一个主要抗原系统，由rhd和rhce基因共同表达；rhd基因编码d抗原，而rhce基因编码cc、ee 抗原。当红细胞上存在d抗原时，即rh阳性rh（+）；当红细胞上缺乏d抗原时，即rh阴性rh（-）。当rh阴性女性怀有rh阳性血型胎儿时可发生母胎血型不合导致的新生儿溶血病。母胎rh血型不合所致胎儿溶血是由于rh阴性母体产生了针对rh阳性胎儿血型抗原的特异性抗体，通过胎盘进入胎儿血循环，从而引起胎儿红细胞破坏，发生胎儿溶血性贫血，重度贫血可引起胎儿贫血、缺氧、心衰、水肿，甚至死胎、新生儿死亡等严重后果。其轻重程度和母亲体内rh抗体量、胎儿红细胞被致敏程度以及胎儿的代偿能力等因素有关。注射抗-d免疫球蛋白是目前预防母体致敏的主要方法。抗d免疫球蛋白可以破坏进入母体血液的rh-(d) 抗原，抑制母体血液产生抗rh-(d) 抗体。一般是在孕期28周和婴儿出生后72小时内，肌注抗rh(d)免疫球蛋白，能阻止胎儿rhd阳性红细胞对母体的致敏作用，预防新生儿溶血症。
2、由于抗-d免疫球蛋白为人血提取物，较为稀缺，仅建议对有必要使用的孕妇进行注射（即rhd阴性血型母亲+rhd阳性血型胎儿），因此明确胎儿血型非常重要。当胎儿的血型不能确定时，传统的产前诊断可能依靠穿刺明确胎儿血型。但是由于穿刺本身的风险，同时可能使已致敏的孕妇产生更多的抗体，易引起胎儿流产或加重溶血病情。随着无创产前筛查技术的发展，现已可通过孕妇外周血细胞胎儿游离dna检测技术明确胎儿rhd血型，避免因穿刺带来的风险，在临床处理及医疗成本效益等方面具有重要意义。
3、目前可利用的确定胎儿 rhd 状态的方法通常需要侵入性过程以获得用于测试的胎儿细胞。例如，可进行绒毛膜取样 (cvs) 或羊膜穿刺法以筛选 rhd 状态或遗传异常。然而，自发性流产、感染和异源免疫均与这样的侵入性过程相关。因此，希望开发出确定胎儿rhd 状态的非侵入性过程，以避免与侵入性诊断测试相关的并发症和不必要地给予昂贵的预防治疗。
4、rhd和rhce基因高度同源，同时在孕妇12-16周时外周血中胎儿的cffdna在总cffdna的占比仅为10％，如何在这种高背景下准确的检测出胎儿的rhd基因分型是该领域难以解决的问题。
5、
6、
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测人类家系及孕妇胎儿游离dna的rh血型基因型的引物探针组。
2、本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒。
3、本发明还提供了上述引物探针组在检测人类家系rh血型基因型中的应用。
4、本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
5、本发明提供了一种检测人类家系及孕妇胎儿游离dna的rh血型基因型的引物探针组，具体为：
6、（1）当检测孕妇外周血白细胞或者口腔咽拭子脱落细胞核酸基因分型时，所述引物探针组1的序列为：
7、rj-rhd1227上游引物如seq id no.1所示：
8、5’ cgttttgacacacaatatttcgatt 3’；
9、rj-rhd1227下游引物如seq id no.2所示：
10、5'ctcataaacagcaagtcaacatatatact 3'；
11、rj-rhd1227探针如seq id no.3所示：
12、fam-5' tgtgaaaaatcttaccttccagaaaacttg 3'-bhq1；
13、（2）当检测孕妇游离dna来鉴定胎儿rhd基因分型时，所述引物探针组2的序列为：
14、rhd缺失上游引物如seq id no.4所示：
15、5' ctaccacatgaacatgatgcaca 3'
16、rhd缺失下游引物如seq id no.5所示：
17、5' gggtatcgttgctgtctgatct 3'
18、rhd缺失探针如seq id no.6所示：
19、fam-5' cctattttgggctgtctgtggcct 3'-bhq1
20、rhd缺失内参上游引物如seq id no.7所示：
21、5' cctctgacttcaacagcgacac 3'
22、rhd缺失内参下游引物如seq id no.8所示：
23、5' atgagcttgacaaagtggtcgt 3'
24、rhd缺失内参探针如seq id no.9所示：
25、vic-5' acctttgacgctggggctggcattg 3'-bhq1
26、rhd1227上游引物如seq id no.10所示：
27、5' ttaaacaggtttgctcctaaatctt 3'
28、rhd1227下游引物如seq id no.11所示：
29、5' ctatcacgttaataggtgaaaaatctttct 3'
30、rhd1227探针如seq id no.12所示：
31、fam-5' aatatttagcctcatgaggtgctttcc 3'-bhq1
32、rhd1227内参上游引物如seq id no.13所示：
33、5' aatcccaaaagatactacgtggtg 3'
34、rhd1227内参下游引物如seq id no.14所示：
35、5' acattcagagttcataaatttcaacaa 3'
36、rhd1227内参探针如seq id no.15所示：
37、vic-5' ctcagaaacaaagcatgactggcatta 3'-bhq1；
38、rhd 缺失sshb如seq id no.16所示：
39、5' catgaacctgaggcacttctacg-c3spacer 3'
40、rhd1227 sshb如seq id no.17所示：
41、5' taggtgaaaaatcttaccttccagaa-c3spacer 3'。
42、本发明还提供了一种含有上述引物探针组的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针组1或引物探针组2，反应buffer和taq酶组成。
43、本发明所提供的试剂盒中：
44、（1）当试剂盒含有引物探针组1时，具体组成为：
45、
46、（2）当试剂盒含有引物探针组2时：
47、rhd缺失体系为：
48、
49、g1227a体系为：
50、
51、本发明还提供了一种利用上述试剂盒在检测检测人类家系及孕妇胎儿游离dna的rh血型基因型中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
52、（1）利用探针熔解曲线的方法检测孕妇外周血白细胞或者口腔咽拭子脱落细胞核酸基因分型检测；
53、（2）然后利用arms+sequence specific high-blocker（sshb）无创检测孕妇游离dna来鉴定胎儿rhd基因分型。
54、进一步的，步骤（1）中进行检测时，pcr扩增程序为：
55、
56、进一步的，步骤（2）中，具体为：征集rh阴性血型孕妇（12-28周）家系（血清学检测）的临床样本，通过一代测序进行孕妇血液白细胞核酸基因分型检测，确定孕妇的rhd基因分型，用于配制rh阳性（rhd野生型）梯度dna核酸：0.005ng/μl、0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl；配制rh阳性（rhd g1227a杂合突变型）梯度dna核酸：0.005ng/μl、0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl；配制rh阴性（ rhd g1227a纯合突变型）梯度dna核酸：0.005ng/μl、0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl；配制rh阴性（ rhd 纯合缺失型）梯度dna核酸：0.005ng/μl、0.01ng/μl、0.1ng/μl、1ng/μl；针对rhd缺失型孕妇外周血进行cffdna提取和qpcr检测。
57、进一步的，步骤（2）中进行检测时，pcr扩增程序为：
58、。
59、本发明利用arms+sequence specific high-blocker（sshb），结合特定的反应程序的方法，检测孕妇(rhd基因纯合缺失型)外周血胎儿cffdna基因分型，要包括引物，检测探针，sequence specific high-blocker（sshb）,反应buffer和taq酶组成；体系一中在高退火温度下sshb优先和rhce基因模板(母亲和胎儿)或进行充分结合，在低退火温度下sshb和rhd基因模板不结合或者极少量结合且引物和rhd基因模板充分结合；体系二中高退火温度下sshb优先和rhce基因模板(母亲和胎儿)、rhd基因野生型模板进行充分结合，在低退火温度下sshb和rhd基因突变型模板不结合或者极少量结合且引物和rhd基因突变型模板充分结合；通过上述方法能够抑制母亲以及胎儿本身中rhce基因背景的扩增（30ng rhce基因组模板在qpcr中无荧光信号），同时极大的提高rhd的检测效率（可以检测出1ng cffdna中10％的点突变和缺失）。
60、与现有rh血型基因检测方法相比，本发明具有以下优势：
61、（1）本发明包含了中国人群rh阴性血型最常见的基因突变：rhd基因缺失和rhdg1227a突变型两种，覆盖了中国人群rh阴性90％以上的基因分型。
62、（2）本发明中利用探针熔解曲线的方法开发出的rhd基因分型检测体系只需要1ngdna核酸样本、1管qpcr就可以检测新生儿、成人（包含已孕夫妇）的rhd基因分型，可以为血清学检测结果为rh阴性的孕妇进行初筛，确定是否可以做孕血胎儿无创rhd基因分型检测。
63、（3）本发明所述的孕血胎儿无创rhd基因分型检测检测方法灵敏度高，在qpcr检测平台，1ng的cffdna核酸中可以检测到10％的突变频率。
64、（4）本发明所述的孕血胎儿无创rhd基因分型检测通用性强，该技术也可以应用到数字pcr平台中。