一种TEX101重组蛋白及其在制备单克隆抗体中的应用的制作方法

一种tex101重组蛋白及其在制备单克隆抗体中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种杂合肽，尤其涉及一种人源杂合肽。


背景技术：

2.无精子症是指在射精过程中完全没有精子。它占男性不育病例的10-15％。分为阻塞性无精子症和非阻塞性无精子症(noa)。无精子症占所有无精子症病例的60％。
3.tex101，又名睾丸表达蛋白101，已公开的氨基酸序列如uniprotkb-q9by14(tx101_human)(序列详见seq id no:4)，是一种细胞特异性糖蛋白，以糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定蛋白的形式存在干细胞表面，在男性性腺发育过程中，它首先出现在胎儿睾丸未成熟精索的早孕细胞膜上，虽然tex101不表达在精原细胞上，但它在青春期后减数分裂细胞和睾丸精子上重新出现，tex101随后在运输过程中通过附睾头从附睾精子表面释放，tex101-/-小鼠产生形态完整的精子，不育表型是由于精子无法迁移到输卵管。关于230例的研究中得出，tex101对于鉴别梗阻性无精症oa和非梗阻性无精症noa的敏感性为73％，特异性为100％，远远高于现有相关的技术，具有极高的诊断价值。因此，研发特异性和灵敏度高的单克隆抗体及检测试剂盒对tex101的临床诊断具有重要意义。
4.关于采用tex101抗体来检测精子活性的方法，现有技术中有零星的披露(譬如中国专利文献cn108548928a、cn112630436a和cn112630451a等)，但关于单克隆抗体的制备方法，尤其是免疫用tex101重组蛋白的制备方法却未见披露。
5.开发高灵敏度的诊断试剂盒必须依赖能结合天然构象蛋白的单克隆抗体。由于天然蛋白的大量纯化技术目前还不成熟，因此，在制备单克隆抗体时会优先选择肽段，蛋白质片段，全长的重组蛋白来进行动物免疫。但是按照上述方法生产的单克隆抗体很有可能无法识别生物样本中的天然构象蛋白，使用这些抗体开发的检测试剂盒无法在临床检验中提供可靠的检测结果。
6.因此，如何构建一种tex101重组蛋白，使得用其制备的单克隆抗体可以识别生物样本中的天然构象蛋白成为亟待解决的难题。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是提供一种tex101重组蛋白，使得用其制备的单克隆抗体可以识别生物样本中的天然构象蛋白成为亟待解决的难题。
8.本发明所要解决的另一个技术问题是用所述tex101重组蛋白来制备单克隆抗体。
9.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
10.一种tex101重组蛋白，所述的重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
11.具体的，氨基酸序列如下：
[0012][0013]
与已披露的uniprotkb-q9by14(tx101_human)相比，存在下列差异：
[0014]
(1)第46-47、49-50位的氨基酸不同；
[0015]
(2)q9by14中第228-230位的氨基酸在本发明序列中缺失。
[0016]
进一步的，所述tex101蛋白为人源。
[0017]
tex101重组蛋白的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
[0018]
(1)根据已公开的人类tex101的mrma基因序列设计引物,通过逆转录合成cdna文库；
[0019]
(2)以步骤(1)合成的cdna文库作为模板，通过pcr方式进行扩增；
[0020]
(3)将步骤(2)扩增后回收的dna片段与ppic表达载体链接，酶切位点为：xho1和ecor1；
[0021]
(4)将步骤(3)构建好的表达载体通过电转方式转化入gs115酵母细胞系中；
[0022]
(5)在毕赤酵母表达培养基bmgy中培养酵母细胞株至对数期,转入bmmy培养基中，调整至od600＝1，于30度恒温摇床培养；10ml/l浓度的甲醇诱导表达4天；
[0023]
(6)取上清液，使用鼠抗his标签抗体通过westerblot方法鉴定蛋白表达；
[0024]
(7)sds凝胶中回收蛋白条带，使用质谱进行蛋白鉴定；
[0025]
(8)亲和层析法从酵母培养上清液中纯化tex101重组蛋白。
[0026]
进一步的，所述步骤(1)中，所述人类tex101的mrma基因序列在genbank中的登录号是nm_001130011.1。
[0027]
进一步的，所述步骤(1)中，所述引物的序列如下：
[0028][0029]
进一步的，所述步骤(3)中，所述pcr扩增的pcr mix体系：按下表配制pcr反应液：
[0030]
[0031][0032]
进一步的，所述步骤(3)中，所述pcr扩增的反应条件如下：
[0033]
95℃
×
3min变性后用touchdown方式进行基因扩增，第一个循环为94℃
×
45s，65℃
×
45s，72℃
×
2min，此后每个循环的退火温度下降1℃，当退火温度下降到57℃时，则以94℃
×
45s，57℃
×
45s，72℃
×
2min运行35个循环，再于72℃延伸10min后结束反应。
[0034]
本发明tex101重组蛋白在制备单克隆抗体中的应用。
[0035]
进一步的，所述制备单克隆抗体的方法如下：将tex101重组蛋白作为抗原免疫6周龄的雌性balb/c小鼠，收集免疫脾细胞，与ns-1骨髓瘤细胞进行融合构建杂交瘤细胞，通过所述杂交瘤细胞产生单克隆抗体。
[0036]
与现有技术相比，本发明的有益技术效果至少可以体现在如下几个方面：
[0037]
(1)与已披露的uniprotkb-q9by14(tx101_human)相比，本发明tex101重组蛋白更易于制备单克隆抗体。
[0038]
由下文对比试验可知，在进行细胞融合时，考察在所有融合成功的孔中阳性孔所占的比例(即融合阳性率)，本发明的融合阳性率为74％，明显高于对比例的53％。
[0039]
(2)与已披露的uniprotkb-q9by14(tx101_human)相比，本发明tex101重组蛋白制备的单克隆抗体更容易识别生物样本中的天然构象蛋白tex101。
[0040]
由下文对比试验可知，在对10例健康人精液样本的检测中，应用本发明重组蛋白所构建的双抗体夹心法检测体系的准确率是100％，优于对比例的80％。
具体实施方式
[0041]
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。本发明实施例所用的材料均可以通过商业渠道获得。
[0042]
实施例1tex101重组蛋白的制备
[0043]
(1)根据已公开的人类tex101的mrma基因序列设计引物,通过逆转录合成cdna文库；
[0044]
所述人类tex101的mrma基因序列在genbank中的登录号是nm_001130011.1；
[0045]
所述引物的序列如下：
[0046]
表1引物序列
[0047][0048]
(2)以步骤(1)合成的cdna文库作为模板，通过pcr方式进行扩增；
[0049]
pcr mix体系：按下表配制pcr反应液：
[0050][0051][0052]
所述pcr扩增的反应条件如下：
[0053]
95℃
×
3min变性后用touchdown方式进行基因扩增，第一个循环为94℃
×
45s，65℃
×
45s，72℃
×
2min，此后每个循环的退火温度下降1℃，当退火温度下降到57℃时，则以94℃
×
45s，57℃
×
45s，72℃
×
2min运行35个循环，再于72℃延伸10min后结束反应；
[0054]
(3)将步骤(2)扩增后回收的dna片段与ppic表达载体链接，酶切位点为：xho1和ecor1；
[0055]
(4)将步骤(3)构建好的表达载体通过电转方式转化入gs115酵母细胞系中；
[0056]
(5)在毕赤酵母表达培养基bmgy中培养酵母细胞株至对数期(od
600
＝2-6),转入bmmy培养基中，调整至od
600
＝1，于30度恒温摇床培养；10ml/l浓度的甲醇诱导表达4天；
[0057]
(6)取上清液，使用鼠抗his标签抗体通过westerblot方法鉴定蛋白表达；
[0058]
(7)sds凝胶中回收蛋白条带，使用质谱进行蛋白鉴定；
[0059]
(8)亲和层析法从酵母培养上清液中纯化精液tex101重组蛋白。
[0060]
实施例2应用本发明重组蛋白制备单克隆抗体
[0061]
1.动物免疫
[0062]
用实施例1制备的tex101重组蛋白作为抗原免疫6周龄的雌性balb/c小鼠6只，免疫程序为：背部皮下分2点注射等量福氏完全佐剂乳化的重组抗原，免疫总剂量为30μg/只；2周后皮下分点注射等量福氏不完全佐剂乳化的重组抗原，剂量不变，3周后进行第三次常规免疫，每次免疫后3周尾部采血，并用间接elisa检测小鼠产生的抗体滴度；间隔至少1月后，在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为15ug/只，进行加强免疫一次。
[0063]
2.细胞融合
[0064]
2.1ns-1骨髓瘤细胞的制备
[0065]
于融合前一周，将实验室保存在液氮中的ns-1骨髓瘤细胞复苏，培养在24孔细胞培养板中。用15％胎牛血清dmem培养液传代培养一周，调整细胞浓度为106个/ml。融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞，弃掉原来瓶内的培养基，加入适量无血清dmem培养液，将细胞轻轻吹下，移入50ml离心管，l000rpm离心5分钟，洗涤细胞2次，弃上清，细胞沉淀用无血清培养液重悬，计数备用。
[0066]
2.2免疫脾细胞的制备
[0067]
(1)取免疫的balb/c鼠一只，眼眶放血处死，75％酒精中浸泡5min消毒。
[0068]
(2)在超净台内，将消毒好的小鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢交叉(左后肢在上)固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；
[0069]
(3)将脾脏用无血清培养液冲洗后，移入盛有5ml无血清培养液的无菌玻璃培养皿中，置100目铜网上，用无菌剪刀将脾脏剪成3-5块，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗铜网，收集脾细胞悬液；
[0070]
(4)1000rpm，离心5min，洗细胞2次，弃上清液，细胞沉淀用无血清培养液悬浮后计数。
[0071]
2.3饲养细胞的制备
[0072]
(1)取一只未免疫的balb/c鼠，眼眶放血，浸泡于75％酒精中5min。
[0073]
(2)将小鼠移至干净的超净台内，以仰卧位固定在解剖台板上，剪开腹部皮肤，暴露腹部，在腹膜上剪一小口(在腹部中央)，然后用吸管吸3ml无血清培养液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放置于50ml离心管中，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。
[0074]
(3)1000r/min离心l0min去上清，细胞重悬后计数，用hat培养基悬浮后，置于37℃，5％co2培养箱中待用。
[0075]
2.4细胞融合
[0076]
(1)将ns-1骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1:10比例在50ml离心管中混匀，1000r/min离心5min。
[0077]
(2)用滴管吸净残留液体，用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管用手握住管底。然后在lmin内慢慢滴入预温至37℃的融合用50％peg溶液0.5ml，边加边摇。
[0078]
(3)用双手作用90秒钟，然后慢慢加入37℃预温的dmem基本培养基10ml。具体方法为：第一分钟逐滴滴入lml，第二分钟加lml，第3min-4min加3ml，5min后加其余的5ml，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地摇动离心管。完毕后置于离心机中600rpm/min离心5分钟，弃上清。
[0079]
(4)融合后的细胞沉淀用2.5ml完全培养液轻悬加入22.5ml半固体培养基混匀后倒入直径3.5cm的平皿中，每个平皿约2ml，37℃，5％co2培养。
[0080]
(5)一周后肉眼可见平皿的培养基表面有白色斑点，显微镜下即为细胞克隆团。无菌条件下将平皿中分散的、单个的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养。
[0081]
3.杂交瘤细胞筛选和克隆化
[0082]
3.1间接elisa方法检测杂交瘤细胞上清
[0083]
(1)包被调整抗原浓度为1ng/ul，每孔包被体积为100ul，4℃过夜包被。
[0084]
(2)封闭次日将孔内包被液体甩净，每孔加入200ul，3％bsa封闭液，37℃封闭1.5h。
[0085]
(3)加入一抗洗板5次，用力甩干。以抗鱼小清蛋白融合细胞培养上清液作为一抗，37℃孵育1h。
[0086]
(4)加入二抗洗板5次，用力甩干，hrp－羊抗小鼠igg为二抗，稀释比例为1:4000，每孔加入100ul，37℃孵育1h。
[0087]
(5)显色tmb显色液a/b液每孔各50ul，37℃孵育15min。
[0088]
(6)终止每孔加入50ul 2mm硫酸。
[0089]
(7)读数a450nm读板，记录数据，测定孔读数与阴性对照值之比大于2.1为阳性。
[0090]
3.2杂交瘤细胞的克隆化
[0091]
经间接elisa方法连续检测两次都为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆，克隆前一天制备小鼠饲养细胞层。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。将细胞用完全培养基稀释到每毫升5、10、50个细胞。将上述三个浓度的细胞悬液分别加入己制备好的饲养细胞的96孔培养板中100μl/孔。使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞。培养第4天半量换液一次，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。在克隆后第10-14天，细胞长满约1/4-1/2孔底时，进行全量换液，次日进行间接elisa检测。如检出细胞生长孔有特异性抗tex101蛋白抗体，选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆，一般克隆2次。2次后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，可冻存杂交瘤细胞。
[0092]
4.单克隆抗体生产
[0093]
4.1对己经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在balb/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体。
[0094]
4.2抗体纯化参照hitrap protein g亲和层析说明书进行。
[0095]
4.3sds—page检测纯化后抗体的纯度。
[0096]
实施例3抗体特异性鉴定
[0097]
以人类精浆蛋白作为抗原通过westernblot鉴定抗体特异性。
[0098]
(1)胶sds-page(12％分离胶、5％浓缩胶)电泳。
[0099]
(2)将sds-page胶上蛋白电转到硝酸纤维素膜上，电转条件为：300ma/板；350ma/2板，60min。
[0100]
(3)取下膜，tba洗膜，5min
×
3。
[0101]
(4)将膜置于封闭液中缓慢摇动30min。
[0102]
(5)4℃封闭过夜。
[0103]
(6)按1:2000比例加入纯化的单克隆抗体，37℃孵育2h。
[0104]
(7)回收血清。
[0105]
(8)tbst洗膜，5min
×
3。
[0106]
(9)加入用二抗buffer稀释(1:3000)的生物素标记的羊抗鼠ige抗体(二抗)，37℃孵育2h。
[0107]
(10)tbst洗膜，5min
×
3。
[0108]
(11)加入经hrp标记链霉亲和素buffer稀释(1:1000)的辣根过氧化物酶(hrp)标记的链霉亲和素。37℃孵育1.5h。
[0109]
(12)tbst洗膜，5min
×
3。
[0110]
(13)tbs洗膜，5min
×
3。
[0111]
(14)在膜表面滴加dab显色液，双蒸水洗涤终止显色反应，观察结果。
[0112]
将图像输入电脑，利用bio-rad quantity one 1-d analysis软件进行蛋白分子量分析及含量分析。
[0113]
结果表明，实施例2制备的单克隆抗体具备较佳的特异性。
[0114]
实施例3用于检测精液中tex101浓度的双抗体夹心法检测体系的建立
[0115]
1.抗体生物素化
[0116]
(1)标记实验开始前将sulfo-nhs-biotin放置室温平衡10min。
[0117]
(2)抗体浓度调整至3mg/ul,至于30kd超滤离心柱内，10000r 5min离心，将buffer置换为pbs缓冲液。
[0118]
(3)将10mm sulfo-nhs-biotin溶解于500ul超纯水中。
[0119]
(4)加入预先计算好的体积量的sulfo-nhs-biotin溶液到抗体溶液中。
[0120]
(5)室温避光孵育30min。
[0121]
(6)将反应物至于超滤离心柱中，去下清，将滤膜放回离心管。
[0122]
(7)加入100ul pbs于滤膜上，弃下清，重复3次。
[0123]
(8)将滤膜倒置于新离心管中，收集滤液，滤液为纯化的抗体溶液。
[0124]
(9)-20℃保存抗体。
[0125]
2.双抗体夹心实验筛选配对抗体
[0126]
(1)梯度包被捕获抗体。包被浓度分别为每孔50，100，200，300，400ng/ml，4℃过夜包被。
[0127]
(2)封闭次日将孔内包被液体甩净，每孔加入200ul，3％bsa封闭液，37℃封闭1.5h。
[0128]
(3)洗板3次，用力甩干。加入精液样本，每孔加入100ul，37℃孵育1h。
[0129]
(4)洗板板5次，用力甩干，加入检测抗体，稀释比例为1：1000，1：2000,1:4000,1:5000,1:8000,1:10000,:1:20000，37℃孵育1h。
[0130]
(5)加入商品化链霉亲和素标记的hrp,每孔加入100ul，稀释比例为1：40000，37℃孵育10min。
[0131]
(6)显色tmb显色液a/b液每孔各50ul,37℃孵育15min。
[0132]
(7)终止每孔加入50ul 2mm硫酸。
[0133]
(8)读数a450nm读板,记录数据。
[0134]
根据实验结果，筛选出捕获抗体，最佳包被浓度为400ng/孔；检测抗体(生物素化的)，稀释比例为1：20000。
[0135]
实施例4人精液中tex101蛋白浓度的测定
[0136]
1.标准品制备
[0137]
收集20份健康男性的精液混成样品池，通过质谱方法检测tex101蛋白的浓度。
[0138]
2.收集健康人精液标本10例，稀释1000倍，无精子症患者精液样本10例，稀释100倍，每孔100ul加入微孔板中，微孔板事先包被按实施例3建立的捕获抗体，浓度为400ng/孔，设置标准曲线及阴性对照。室温孵育1.5小时。
[0139]
3.清洗微孔板，每孔加入洗涤液300ul，5次。
[0140]
4.加入生物素化的检测抗体(按实施例3建立)，每孔加入100ul，稀释比例1：20000。室温孵育1.5小时。
[0141]
5.重复步骤2。
[0142]
6.加入链霉亲和素标记的hrp，每孔加入100ul，稀释比例：1：40000，室温孵育1小时。
[0143]
7.重复步骤2。
[0144]
8.加入显色液tmb，每孔加入100ul避光，室温孵育10分钟。
[0145]
9.加入终止液每孔50ul。
[0146]
10.od450nm测定吸光值。
[0147]
检测结果显示，在该检测体系下，可以很好的根据tex101的浓度区分健康人群和无精子症患者。
[0148]
表2tex101浓度
[0149]
[0150][0151]
对比例基于uniprotkb-q9by14(tx101_human)制备单克隆抗体及双抗体夹心法检测体系的建立
[0152]
除用于用作抗原的蛋白不同外，余参照实施例2-4。
[0153]
进行对比试验，考察融合阳性率及检测准确率，具体如下：
[0154]
(1)融合阳性率
[0155]
在进行细胞融合时，考察在所有融合成功的孔中阳性孔所占的比例(即融合阳性率)，鉴定阳性孔的方法参见实施例2的3.1节。
[0156]
结果见表3，结果表明，与已披露的uniprotkb-q9by14(tx101_human)相比，本发明tex101重组蛋白更易于制备单克隆抗体。
[0157]
表3融合阳性率的比较
[0158]
抗原融合阳性率(％)本发明重组蛋白74q9by1453
[0159]
(2)检测准确率
[0160]
利用不同的抗原，参照实施例3的方法，分别构建双抗体夹心法检测体系，对同一批健康人精液样本进行检测，结果见表4，结果表明，利用q9by14单克隆抗体所构建的检测体系并不能完全准确的检出健康人精液中的tex101蛋白浓度，准确率仅为80％(2例未准确检出)。
[0161]
表4检测准确率的比较
[0162][0163][0164]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明技术方案而作的举例，并非对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明要求的保护范围之内。