一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物的制备和应用

1.本发明涉及天然产物分离提纯领域，尤其涉及一种抗氧化节杆菌及其次级代谢产物（arthroxanthin）的制备和应用。


背景技术：

2.几乎所有的人工合成色素都不能向人类提供营养物质，某些合成色素甚至会危害人体健康，引起中毒和癌变等人类健康问题。因此，近年来市场上关于天然、无毒、生态友好型色素的需求量逐渐增大。根据市场调研显示，在各种色素中仅类胡萝卜素一项，到2022年市场份额将达到20亿美元。临床和流行病学研究证明，水果和蔬菜的膳食摄入量越少的人，慢性疾病（如ⅱ型糖尿病、心血管疾病和癌症）的发病率越高。这是由于水果和蔬菜中的生物活性抗氧化化合物，包括类胡萝卜素，能够中和生物体内自由基，从而最大限度地减少氧化损伤和相关疾病的发生率。
3.类胡萝卜素(carotenoids)是广泛分布于植物和微生物中的一类色素。迄今为止，已从天然来源中鉴定出1204个类胡萝卜素，其中大多为c40类胡萝卜素（1121），其次是c50（37）、c30（33）和c45（13）。基于类胡萝卜素数据库(http://carotenoiddb.jp)统计发现，细菌能够合成迄今发现的所有c45、大多数的c30以及c50类胡萝卜素。现有研究报道了179种细菌能够产生类胡萝卜素(数据截止：2020年11月)，主要分布于变形菌门(proteobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)、绿菌门(chlorobi)。
4.近年来，国内外科学家先后分别从土壤中分离到能产生类胡萝卜素的细菌，并建立了较完善的液体发酵产类胡萝卜素体系，制备了类胡萝卜素粗品，通过对其生物活性进行研究，纯化得到的类胡萝卜素均具有较强的抗氧化活性。目前，类胡萝卜素发酵纯化工艺距工业化生产还有很大距离，这在很大程度上限制了其应用。因此，需要进一步研究其发酵纯化工艺，通过工艺优化，改进发酵纯化条件，创造适合菌体生长和生物代谢的最佳条件，充分发挥菌种的生产潜力，显著提高类胡萝卜素产量。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种抗氧化节杆菌。
6.本发明所要解决的另一个技术问题是提供该抗氧化节杆菌的次级代谢产物（arthroxanthin）。
7.本发明所要解决的第三个技术问题是提供该次级代谢产物（arthroxanthin）的制备和应用。
8.本发明所要解决的第四个技术问题是提供该次级代谢产物（arthroxanthin）的应用。
9.为解决上述问题，本发明所述的一种抗氧化节杆菌，其特征在于：该节杆菌来源于珠穆朗玛峰北坡东绒布冰川土壤，其分类命名为抗氧化节杆菌（arthrobacter sp. ql17），
在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmcc 1.2948（保藏单位地址：中国. 广东广州市越秀区先烈中路100号广东省微生物研究所；保藏日期：2021年12月01日）。
10.如上所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物，其特征在于：该次级代谢产物为类胡萝卜素（arthroxanthin），其结构式如下：。
11.如上所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
⑴
固体培养：将在-80℃冰箱中保存的抗氧化节杆菌ql17涂布于r2a琼脂平板培养基上，于15℃培养箱中培养5d，得到平板菌种；
⑵
种子培养：取生长良好的平板菌种，接种于装液量为30%的r2a液体培养基中，在15℃、160rpm的条件下培养72h，得到种子液；
⑶
发酵培养：取生长良好的种子液，按体积分数5%的接种量接种于装液量为30%的r2a液体培养基中，于15℃、160rpm的条件下培养3d，得到菌体；
⑷
菌体的前处理：将菌体加到其5倍体积量的100%甲醇中进行萃取，萃取次数为2次，直至菌体变为无色；合并两次萃取所得，得到类胡萝卜素萃取液；所述类胡萝卜素萃取液经旋转蒸发至干、甲醇复溶，得到类胡萝卜素粗提物；
⑸
正向硅胶柱分离：所述类胡萝卜素粗提物采用干法拌样，在正向硅胶柱上分离纯化，采用石油醚装柱，上样后氯仿-丙酮梯度混合物洗脱，得到a~d四个馏分；其中a馏分体积比为5:1的氯仿和丙酮，b馏分体积比为3:1的氯仿和丙酮，c馏分体积比为1:1的氯仿和丙酮，d为甲醇洗脱；
⑹
sephadex lh-20 分子筛分离：在体积比为1:1的chcl3和meoh构成的流动相中，将所述步骤
⑸
所得的馏分c在sephadex lh-20 分子筛上反复纯化和分离，共得到14个馏分，其中红色液体确定为馏分c12；
⑺
半制备型高效液相色谱分离：将所述馏分c12用半制备型高效液相色谱 (hplc) c18 柱纯化，即得次级代谢产物类胡萝卜素纯品。
12.所述步骤
⑴
中r2a琼脂平板培养基是指将酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g、20g琼脂与1l纯水混合均匀后，即得。
13.所述步骤
⑵
和所述步骤
⑶
中r2a液体培养基是指将酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g与1l纯水混合均匀后，即得。
14.所述步骤
⑸
中正向硅胶柱分离的条件是指正向硅胶柱的尺寸为5 cm
ꢀ×ꢀ
60 cm，
填充高度 40 cm，硅胶粒径为100~200目。
15.所述步骤
⑸
中梯度洗脱的氯仿-丙酮的体积比依次为5:1, 3:1, 1:1。
16.所述步骤
⑺
中c18 柱的尺寸为10 mm
ꢀ×ꢀ
250 mm, 填充高度 250 mm。
17.所述步骤
⑺
中半制备型高效液相色谱分离的条件是指流动相由体积比为9:1的meoh和h2o构成；进样前基线稳定10min后进样，每次进样1ml；检测器波长为254nm，流动相流速为2.0 ml/min；收集含新型类胡萝卜素纯品的的出峰时间为34min。
18.如上所述的一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物在抗氧化方面的应用，其特征在于：该次级代谢产物对二苯基苦基苯肼自由基（dpph）具有抑制作用，其半抑制浓度ic
50
为69.82
ꢀµ
g/ml。
19.本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明首次公开了一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物arthroxanthin的制备方法及该类胡萝卜素的清除dpph自由基能力，对后续arthroxanthin的工业开发都具有重大意义。
20.2、本发明新型类胡萝卜素（arthroxanthin）的制备方法具有快速、高效的特点，可大幅提高次级代谢产物arthroxanthin产量及arthroxanthin的纯度。
附图说明
21.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
22.图1为本发明菌株ql17与相关菌株的系统发育图和菌落形态图。其中：a为菌株ql17的系统发育图，b为菌株ql17的菌落形态图。
23.图2为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的核磁鉴定1h谱。
24.图3为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的核磁鉴定
13
c谱。
25.图4为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的核磁鉴定hhcosy谱。
26.图5为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的核磁鉴定hmbc谱。
27.图6为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的核磁鉴定hsqc谱。
28.图7为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的高效液相色谱（hplc）图。
29.图8为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的microtof-q质谱图。
30.图9为本发明类胡萝卜素（arthroxanthin）的dpph自由基清除能力实验结果。
具体实施方式
31.一种抗氧化节杆菌，该节杆菌来源于珠穆朗玛峰北坡（28.02
°
n，86.56
°
e）东绒布冰川土壤。将5g土壤分散在25 ml无菌生理盐水溶液中并用磷酸盐缓冲溶液连续稀释来进行取样。将100μl悬浮液涂抹在r2a琼脂板上，并在15℃有氧条件下培养。随后，通过在15℃的r2a培养基上反复划线来纯化单个形态多样的菌落，并将所得纯培养物保持在-80℃。共获得93株不同菌株，其中62.4%属于放线菌门，19.4%属于变形菌门，13.3%属于厚壁菌门，2.2%属于拟杆菌门，2.2%属于奇异球菌。通过对从珠穆朗玛峰地区分离得到的93株细菌进行抗氧化活性研究，发现了一株菌株编号为ql17菌株（如图1b所示），分类命名为抗氧化节杆菌（arthrobacter sp. ql17），具有很强的抗氧化活性。在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmcc 1.2948（保藏单位地址：中国. 广东广州市越秀区先烈中路100号广东省
微生物研究所；保藏日期：2021年12月01日）。
32.一种抗氧化节杆菌的次级代谢产物，该次级代谢产物为类胡萝卜素（arthroxanthin），为红色粉末，采用nmr核磁分析和microtof-q质谱分析（参见图2~8所示），其结构式如下：。
33.该抗氧化节杆菌的次级代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
⑴
固体培养：将在-80℃冰箱中保存的抗氧化节杆菌ql17涂布于r2a琼脂平板培养基上，于15℃培养箱中培养5d，得到平板菌种。
34.r2a琼脂平板培养基是指将酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g、20g琼脂与1l纯水混合均匀后，即得。
35.该菌株在平板培养初期呈现粉色半透明，菌落呈圆形，表面光滑湿润，随着培养时间的延长，菌落周围开始分泌蓝色光晕，直至覆盖整个培养基。
36.⑵
种子培养：取生长良好的平板菌种，接种于装液量为30%的r2a液体培养基中，在15℃、160rpm的条件下培养72h，得到种子液。
37.r2a液体培养基是指将酵母浸出粉0.5g、蛋白胨0.5g、酪蛋白水解物0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、磷酸氢二钾0.3g、无水硫酸镁0.024g、丙酮酸钠0.3g与1l纯水混合均匀后，即得。
38.⑶
发酵培养：取生长良好的种子液，按体积分数5%的接种量接种于装液量为30%的r2a液体培养基中，于15℃、160rpm的条件下培养3d，得到菌体。
39.液体培养基同步骤
⑵
。
40.⑷
菌体的前处理：将菌体加到其5倍体积量的100%(v/v)甲醇中进行萃取，萃取次数为2次，直至菌体变为无色；合并两次萃取所得，得到类胡萝卜素萃取液；类胡萝卜素萃取液经旋转蒸发至干、少量甲醇复溶，得到类胡萝卜素粗提物。
41.⑸
正向硅胶柱分离：类胡萝卜素粗提物采用干法拌样，在正向硅胶柱（100-200目，5 cm
ꢀ×ꢀ
60 cm，填充高度 40 cm）上分离纯化，采用石油醚装柱，上样后氯仿-丙酮（5:1, 3:1, 1:1）梯度混合物洗脱，得到a~d四个馏分。其中a馏分体积比为5:1的氯仿和丙酮，b馏分体积比为3:1的氯仿和丙酮，c馏分体积比为1:1的氯仿和丙酮，d为甲醇洗脱。
42.⑹
sephadex lh-20 分子筛分离：在体积比为1:1的chcl3和meoh构成的流动相中，将步骤
⑸
所得的馏分c在sephadex lh-20 分子筛上反复纯化和分离，共得到14个馏分，其中红色液体确定为馏分c12。
43.⑺
半制备型高效液相色谱分离：将馏分c12用半制备型高效液相色谱 (hplc) c18 柱 (spq05-2510wt, high quality & expert co., beijing, china; 10 mm
ꢀ×ꢀ
250 mm, 填充高度 250 mm)纯化，即得次级代谢产物类胡萝卜素纯品。
44.半制备型高效液相色谱分离的条件是指流动相由体积比为9:1的meoh和h2o构成；进样前基线稳定10min后进样，每次进样1ml；检测器波长为254nm，流动相流速为2.0 ml/min；收集含新型类胡萝卜素纯品的的出峰时间为34min。
45.该抗氧化节杆菌的次级代谢产物在抗氧化方面的应用：以该次级代谢产物为供体，采用微孔板定量法分析测定其对二苯基苦基苯肼自由基（dpph）的清除能力。具体测定方法如下：500 μl样品与500 μl 的 0.4 mmol/l dpph 乙醇溶液混合，空白组以等体积无水乙醇代替 dpph 溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，混匀后在室温下避光反应 30 min，并在6000 r/min 离心10 min，取上清液，以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液调零，于517 nm 测定吸光度。
46.dpph 自由基清除率计算公式为：清除率=[1
−
(as
−
ab)/ac]
×
100%式中：ab 为空白组吸光度，ac 为对照组吸光度，as为样品组吸光度。
[0047]
结果如图9所示。由图9可以发现该次级代谢产物对二苯基苦基苯肼自由基（dpph）具有抑制作用，其半抑制浓度ic
50
为69.82
ꢀµ
g/ml。