1.本发明涉及复合蛋白酶稳定剂及其应用，特别是指一种复合中性蛋白酶稳定剂及其应用。
背景技术：
2.中性蛋白酶(protease)是一种由内肽酶组成的内切酶，能够在中性或弱酸、弱碱性环境中有催化蛋白质水解产生游离氨基酸和多肽片段的酶的总称，其最适作用ph值为6.0～7.5。中性蛋白酶作用条件温和，催化效率较高，被广泛应用于食品、医药、皮革、饲料、化工和废弃物处理。
3.目前商品化的中性蛋白酶制剂以固体粉末为主要剂型。粉末剂型虽然储存和运输方便，但中性蛋白酶易发生自溶现象，即使低温冷冻干燥，也会损失大量酶活。液体蛋白酶由于外界条件(高温高湿等)的限制，运输过程中的储存稳定性存在着很大的问题，主要表现为长途运输中胀气、高温条件下酶活急剧下降、存放时间过长导致酶制剂酶活性下降、出现浑浊现象等。
4.国内在售的液体中性蛋白酶种类极少，均为进口产品且价格高昂。拉丁文名称为bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.14837的枯草芽孢杆菌系申请人通过基因重组的方法构建的脱毛用工程菌，其发酵生产的终产物为中性蛋白酶jw-3。
5.本领域人员公知，在25℃～40℃的保存条件下硼砂能够更好地减缓酶活的损失。经申请人试验证实，对于中性蛋白酶jw-3添加硼砂稳定剂在温度为40℃的条件下保存2天后，酶活保存率为60％左右；而不添加任何保护剂的中性蛋白酶jw-3在温度为40℃的条件下保存2天后酶活保存率为70％左右。公开号为cn108048441a的专利文献中公开了一种用于稳定洗衣液中蛋白酶的复合稳定剂，所述稳定剂包含柠檬酸铵钙和烷基糖苷表面活性剂，在添加复合稳定剂条件下37℃保存3周后酶活保存率达到84.3％和71.5％。但中性蛋白酶jw-3在柠檬酸铵钙和烷基糖苷表面活性剂中稳定性较差，在温度为37℃的条件下保存3周后酶活保存率为60％左右。公开号为cn108977428a的专利文献中公开了菠萝蛋白酶稳定剂及其制备方法和应用，其稳定剂由d-异抗坏血酸钠、l-半胱氨酸、乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠、山梨酸钾和维生素b9组成，但中性蛋白酶jw-3在该组分下酶活保存率为60％左右。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种复合中性蛋白酶稳定剂及其应用，可有效解决中性蛋白酶jw-3酶活保存率低的问题。
7.本发明的整体技术构思是：
8.复合中性蛋白酶稳定剂，包括单位质量份的原料：
9.na2so
4 10～20；蛋白胨2～10；aprotinin 60～200u/ml；ph＝6.0-7.0。
10.复合中性蛋白酶稳定剂在中性蛋白酶制剂制备中的应用。
11.本发明的具体技术特征还有：
12.优选的技术方案是，aprotinin由北京索莱宝科技有限公司生产，其cas为90087-70-1，货号为a8260。
13.优选的技术方案是，ph采用naoh或hcl调节。
14.复合中性蛋白酶稳定剂在中性蛋白酶制剂制备中的应用，包括如下步骤：
15.a、选用拉丁文名称为bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.14837的枯草芽孢杆菌发酵制备的中性蛋白酶jw-3，高速离心取上清液，过滤，稀释制成酶活为2000u/ml的蛋白酶水溶液；
16.b、按照蛋白酶水溶液质量10％～20％的比例加入na2so4，加入蛋白酶水溶液质量2％～10％的蛋白胨，按照60～200u/ml的添加量加入aprotinin，调节混合液的ph＝6.0-7.0。
17.所述的步骤a中高速离心的转速为7000转/分钟，时间为15分钟。
18.所述的步骤a中过滤选用10号硅藻土。
19.为进一步测定采用本发明的方法所获得的复合中性蛋白酶稳定剂的功能性指标，对产品进行较为全面和科学的评价，申请人进行了如下试验：
20.1.升温加速试验
21.蛋白酶在不同温度下的失活速率不同，随着温度的升高，失活速率加快。为缩短试验时间，本发明采用升温加速试验，即通过考察40℃下酶的失活情况来推断酶液在25℃下的稳定性。为此，分别测定了该酶在25℃和40℃下保存48h后的酶活与相对酶活。
22.温度/℃酶活/u.ml-1
酶活保存率/％40496.63
±
13.6134.85
±
0.96251330.76
±
24.0393.38
±
1.69
23.注：初始酶活为1425.14
±
40.04u.ml-1
24.1、失活速率常数kd的测定
25.酶液在不添加底物的情况下，其失活模型假设符合：活性酶分子[ea]系通过不可逆的构型变化或化学变化而成为无活性的蛋白质[ei]，该失活反应为一级反应，即酶的失活速率正比于活性酶浓度[ea]：
[0026]dea
/d
t
＝-kd[ea]
ꢀꢀꢀꢀ
(1)
[0027]
由(1)可得：kd＝-1/t*ln(e
a,t
/e
a,0
)
ꢀꢀ
(2)
[0028]
式中：kd——失活速率常数(1/h)
[0029]ea,0
、e
a,t
——分别为0、t小时的酶活(u/ml)
[0030]
t——失活过程的时间(h)
[0031]
由(2)式及表数据可求得：
[0032]
25℃时k
d,298
＝1.42
×
10-3
/h40℃时k
d,313
＝2.20
×
10-2
/h
[0033]
(其中298和313分别为25℃和40℃时的绝对温度)
[0034]
2.活化能δe的求测
[0035]
由阿累尼乌斯方程：kd＝ae-δe/rt
ꢀꢀ
(3)
[0036]
可得：ln(k
d,t2
/k
d,t
)＝δe/r
×
(1/t
1-1/t2)
ꢀꢀꢀꢀ
(4)
[0037]
式中：δe——失活活化能(kj/mol)
[0038]
r——气体常数(8.31j/k
·
mol)
[0039]
t——绝对温度(k)
[0040]
a——频率因子(1/h)
[0041]
代入k
d,298
、k
d,313
值，计算得出该酶的失活活化能δe(25～40℃)为141.61kj/mol。
[0042]
由(3)可得频率因子a＝9.707
×
10-21
/h
[0043]
(3)失活时间t
40
的推测由式(2)可知，40℃和25℃下达到相同酶失活率所需的时间存在如下关系：t
40
＝t
25
×
(k
d,298
/k
d,313
)
ꢀꢀ
(5)
[0044]
按轻工业行业标准《工业用蛋白酶制剂》(qb1805.3-1993)，液体蛋白酶在25℃下保存3个月即90天的酶活保留率≥80％即为合格，本发明采用40℃的升温试验，故相应保存时间t
40
＝139.42h≈139h，即40℃保存139小时所得结果可近似相当于25℃下存放3个月的酶活保留率。此外，由于加入稳定剂后酶的失活活化能δe有所增加，因而由式(4)计算而得的ln(k
d,298
/k
d,313
)值将比不添加稳定剂时大，即添加稳定剂后40℃保存时间要小于h。但为了确保使用所筛选出的配方于25℃存放3个月仍符合国标要求，在后续的较长周期存放试验中，仍以加速实验条件下(40℃，保温139h)的酶活保留率作为标验液体酶稳定性是否达标的判据。
[0045]
2.酶活保存率的检测
[0046]
蛋白酶酶活的测定方法，参照《gb/t 23527-2009蛋白酶制剂》中附录b的方法。酶活保存率的计算公式：w(％)＝ai/a0×
100(w：酶活保存率；ai：40℃保存139h后测得的酶活；a0：初始酶活力)。
[0047]
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
[0048]
本发明制备的中性蛋白酶稳定剂原料组成及制备方法简单易行，应用于中性蛋白酶jw-3后，酶活保存率显著优于申请人所了解的现有产品或文献报道。
具体实施方式
[0049]
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应理解为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书所做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
[0050]
实施例1
[0051]
选用拉丁文名称为bacillus subtilis，保藏编号为cgmcc no.14837的枯草芽孢杆菌发酵制备的中性蛋白酶jw-3，7000转/分钟离心15分钟后取上清液，10号硅藻土过滤，稀释至酶活为2000u/ml，按照蛋白酶水溶液质量10％比例加入na2so4，加入蛋白酶水溶液质量2％的蛋白胨，按照60u/ml的添加量加入aprotinin，用naoh或hcl调节混合液的ph＝6.0～7.0。
[0052]
实施例2
[0053]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0054]
按照蛋白酶水溶液质量20％比例加入na2so4，加入蛋白酶水溶液质量10％的蛋白胨，按照200u/ml的添加量加入aprotinin，用naoh或hcl调节混合液的ph＝6.0～7.0。
[0055]
其余内容与实施例1相同。
[0056]
实施例3
[0057]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0058]
按照蛋白酶水溶液质量15％比例加入na2so4，加入蛋白酶水溶液质量6％的蛋白胨，按照130u/ml的添加量加入aprotinin，用naoh或hcl调节混合液的ph＝6.0～7.0。
[0059]
其余内容与实施例1相同。
[0060]
实施例4
[0061]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0062]
按照蛋白酶水溶液质量15％比例加入na2so4，加入蛋白酶水溶液质量4％的蛋白胨，按照90u/ml的添加量加入aprotinin，用naoh或hcl调节混合液的ph＝6.0～7.0。
[0063]
其余内容与实施例1相同。
[0064]
实施例5
[0065]
本实施例与实施例1的区别在于：
[0066]
按照蛋白酶水溶液质量16％比例加入na2so4，加入蛋白酶水溶液质量8％的蛋白胨，按照150u/ml的添加量加入aprotinin，用naoh或hcl调节混合液的ph＝6.0～7.0。
[0067]
其余内容与实施例1相同。
[0068]
申请人按照本说明书记载的酶活保存率的测定方法对本技术实施例1～5涉及的产品进行了测试，具体如下：
[0069]
检测地点：河北省微生物研究所有限公司第三研究室
[0070]
检测人员：吴芳彤
[0071]
检测结果如下：
[0072]
将实施例1～5获得的中性蛋白酶jw-3液体制剂分别置于40℃条件下保存139小时，测得酶活保存率见表1，酶制剂类产品易受稳定、ph等影响而致使酶活急剧下降，添加保护剂可显著提高中性蛋白酶jw-3的稳定性。
[0073]
表1蛋白酶酶活保存率
[0074]
试验批次酶活保存率(％)不添加保护剂的中性蛋白酶jw-323.41
±
0.20％实施例193.02
±
0.24％实施例282.27
±
2.01％实施例384.30
±
1.32％实施例493.33
±
1.64％实施例585.76
±
0.88％