一种血脑屏障模型的构建方法

1.本发明涉及医疗模型技术领域，尤其涉及一种血脑屏障模型的构建方法。


背景技术：

2.血脑屏障又称为神经血管单元，由内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞以及内皮细胞之间形成的紧密连接和相应的细胞外基质构成，对中枢神经系统的物质调节及稳态维持发挥着关键作用。研究发现，经全身系统用药后，100％的大分子药物和98％的小分子药物不能透过血脑屏障。因此，跨血脑屏障机制是目前研究的热点。在阿尔茨海默症，帕金森症，肌萎缩侧索硬化症、中风、脑瘤等神经系统疾病进展中，了解血脑屏障在健康组织中发挥的作用及其如何丧失其功能，对于确定潜在的治疗策略至关重要。此外，在评价药物的神经毒性过程中，血脑屏障也是必须考虑的因素之一。
3.3d生物打印本质上是通过将含有细胞或生物活性物质的材料(即生物墨水)以预先设置好的参数组合。与传统的组织工程方法相比，3d生物打印具有高自动化，并具有在活细胞、蛋白质、dna及生长因子等生物活性物质的时空定位上的高精度，高分辨率，以及重复性好等优点。应用喷墨打印机具有成本相对较低、产量高和操作简单等优点，适合于中药新药研发过程中高通量组分筛选、标准化影像数据采集/分析等。
4.由于血脑屏障模型的特殊性，通常需要生成单层脑血管内皮细胞使其具有相应的屏障功能，目前常见的构建方法是首先打印能够支持脑内皮细胞生长的半透膜或微流控装置，再将形成血脑屏障的脑内皮细胞，星形胶质细胞等接种至打印好的装置中，因细胞间存在半透膜，导致缺乏细胞-细胞间及细胞-细胞外基质之间的相互交流；若是将三种细胞同时接种在半透膜一侧，导致三种细胞不能有序生长，因此，采用上述方法构建的血脑屏障模型难以模拟体内血脑屏障的真实情况，此外直接打印活细胞可能会影响其细胞活力，成本较高，操作步骤较为繁琐，模型之间差异较大，且难以实现高通量药物及疾病靶点筛选也限制了其广泛应用。


技术实现要素：

5.针对现有的血脑屏障模型缺乏细胞-细胞间及细胞-细胞外基质之间的相互交流，细胞活力低，步骤繁琐，模型之间差异较大等问题，本发明提供一种血脑屏障模型的构建方法，细胞能够保持较高活力，各类型细胞间直接接触，能很好的模拟体内血脑屏障特征，操作简便，成本较低，形成的血脑屏障类器官之间差异极小，能够实现药物高通量筛选。
6.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
7.一种血脑屏障模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
8.步骤一、制备琼脂糖包被的低吸附孔板；
9.步骤二、分别配制内皮细胞生物墨水、周细胞生物墨水和星形胶质细胞生物墨水；
10.步骤三、在所述低吸附孔板中加入培养基，并将孔板置于喷墨生物打印机上；将所述生物墨水通过所述喷墨生物打印机打印至所述低吸附孔板中，培养，形成血脑屏障模型。
11.相对于现有技术，本技术提供的血脑屏障模型的构建方法，具有以下优势：
12.本技术采用由琼脂糖凝胶包被形成低吸附孔板，并基于喷墨生物打印将脑血管内皮细胞、星形胶质细胞、脑血管周细胞直接打印至低吸附孔板中，打印后的细胞可保持较高活力，且能够快速形成具有相应功能的血脑屏障类器官，各类型细胞间直接接触，能很好的模拟体内血脑屏障特征，操作简便，成本较低，形成的血脑屏障类器官之间差异极小，能够实现药物高通量筛选。
13.采用本技术提供的构建方法，能在规格为96孔板的低吸附孔板上制备细胞活力较高的血脑屏障模型，而且能连续在n块规格为96孔板的低吸附孔板上制备血脑屏障模型，其中，n为大于1的整数。
14.可选的，所述低吸附孔板的制备过程具体为：将琼脂糖溶于水形成琼脂糖凝胶，再将所述琼脂糖凝胶分别加入到孔板的孔中，固化，得到琼脂糖包被的低吸附孔板。
15.可选的，所述琼脂糖凝胶的浓度为0.8wt％～1.5wt％。
16.可选的，所述孔板的每个孔中的琼脂糖凝胶的量为45μl～55μl。
17.可选的，所述固化的条件为：温度为15℃～25℃，时间为12min～17min。
18.可选的，所述内皮细胞(hbmec)生物墨水中内皮细胞的细胞密度为0.8
×
106～1.2
×
106个/ml。
19.上述内皮细胞生物墨水的制备过程为：
20.当hbmec细胞培养至长满培养瓶的85％～90％时，倒掉培养基，用pbs溶液冲洗细胞；
21.向上述培养瓶中加入1.5ml～2.5ml的胰酶溶液，左右倾斜培养瓶以确保胰酶溶液可以完全覆盖细胞，然后将上述培养瓶在37℃培养箱中孵育1min～2min，在显微镜下观察细胞完全变圆且从瓶底脱落，加入5ml的培养基终止消化；
22.收集细胞悬液至离心管中，1000rpm离心5min，离心后弃上清，以2ml pbs溶液重悬细胞，用血小球计数板对细胞密度进行计数，将细胞密度调整至0.8
×
106～1.2
×
106个/ml，室温放置备用。
23.可选的，所述周细胞(hbvp)生物墨水中周细胞的细胞密度为0.8
×
106～1.2
×
106个/ml。
24.上述周细胞生物墨水的制备过程为：
25.当hbvp细胞培养至长满培养瓶的85％～90％时，倒掉培养基，用dpbs溶液冲洗细胞；
26.向上述培养瓶中加入10ml胰酶溶液(9mldpbs+1ml胰酶溶液)，然后将上述培养瓶放入孵箱孵育1min，在显微镜下观察细胞完全变圆且从瓶底脱落，加入5ml的pm培养基终止消化；
27.收集细胞悬液至离心管中，1000rpm离心5min，离心后弃上清，以1ml pm重悬细胞，用血小球计数板对细胞密度进行计数，将细胞密度调整至0.8
×
106～1.2
×
106个/ml，室温放置备用。
28.可选的，所述星形胶质细胞(ha)生物墨水中星形胶质细胞的细胞密度为0.8
×
106～1.2
×
106个/ml。
29.上述星形胶质细胞生物墨水的制备过程为：
30.当ha细胞培养至长满培养瓶的85％～90％时，倒掉培养基，用pbs溶液冲洗细胞；
31.向上述培养瓶中加入1.5ml～2.5ml的胰酶溶液，左右倾斜培养瓶以确保胰酶溶液可以完全覆盖细胞，在显微镜下观察细胞完全变圆且从瓶底脱落，加入5ml的培养基终止消化；
32.收集细胞悬液至离心管中，1000rpm离心5min，离心后弃上清，以2ml培养基重悬细胞，用血小球计数板对细胞密度进行计数，将细胞密度调整至0.8
×
106～1.2
×
106个/ml，室温放置备用。
33.可选的，所述打印的条件为：打印体积为1.8μl～2.3μl，开放时间为3000ms。
34.优选的打印条件使得脑血管内皮细胞、星形胶质细胞、脑血管周细胞迅速构建血脑屏障模型。
35.可选的，所述培养的条件为：温度为36℃～37℃，时间为48h～72h。
36.可选的，所述低吸附孔板的每个孔中的培养基的量为80μl～120μl。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1是本发明试验例1提供的星形胶质细胞活力检测结果；
39.图2是本发明试验例2提供的血脑屏障模型细胞活力检测结果；
40.图3是本发明试验例3提供的血脑屏障模型形态观察结果；
41.图4是本发明试验例3提供的细胞粒径分析图；
42.图5是本发明试验例5提供的紧密连接蛋白(zo-1)的表达结果；
43.图6是本发明试验例5提供的p-糖蛋白(p-gp)的表达结果；
44.图7是本发明试验例5提供的层粘连蛋白(laminin)的表达结果。
具体实施方式
45.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
46.实施例1
47.本发明实施例提供一种血脑屏障模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
48.步骤一、制备琼脂糖包被的低吸附孔板；
49.将琼脂糖0.5g溶于50ml去离子水中，微波加热至琼脂糖融化后，于103.4kpa、温度为121.3℃条件下灭菌30min，形成琼脂糖凝胶；
50.采用5ml移液枪吸取上述琼脂糖凝胶至培养皿中，然后用排枪分别迅速吸取50μl至96孔板的孔中；
51.将含有琼脂糖凝胶的96孔板水平、20℃放置15min使其固化，形成低吸附孔板；
52.步骤二、生物打印前准备工作：打印头置于体积浓度为75％酒精中灭菌30min，然
后再将打印头置于紫外照射灭菌30min；打印机执行
‘
rountin’程序，对打印机的管道进行灭菌：设置打印体积为22μl及电磁微阀开放时间3000ms；
53.步骤三、分别配制人脑微血管内皮细胞(hbmec)生物墨水、人脑血管周细胞(hbvp)生物墨水和人星形胶质细胞(ha)生物墨水；
54.上述hbmec生物墨水的制备过程为：
55.当hbmec细胞培养至长满培养瓶的90％时，倒掉培养基，用pbs溶液冲洗细胞；向上述培养瓶中加入2ml的胰酶溶液，左右倾斜培养瓶以确保胰酶溶液可以完全覆盖细胞；然后将上述培养瓶在37℃培养箱中孵育1.5min，在显微镜下观察细胞完全变圆且从瓶底脱落，加入5ml的培养基终止消化；收集细胞悬液至15ml离心管中，1000rpm离心5min，离心后弃上清，以2ml pbs溶液重悬细胞，用血小球计数板对细胞密度进行计数，将细胞密度调整至1
×
106个/ml，室温放置备用。
56.上述hbvp生物墨水的制备过程为：
57.当hbvp细胞培养至长满培养瓶的90％时，倒掉培养基，用dpbs溶液冲洗细胞；向上述培养瓶中加入10ml胰酶溶液(9mldpbs+1ml胰酶溶液)，然后将上述培养瓶放入孵箱孵育1min，在显微镜下观察细胞完全变圆且从瓶底脱落，加入5ml的pm培养基终止消化；收集细胞悬液至15ml离心管中，1000rpm离心5min，离心后弃上清，以1ml pm重悬细胞，用血小球计数板对细胞密度进行计数，将细胞密度调整至1
×
106个/ml，室温放置备用。
58.上述ha生物墨水的制备过程为：
59.当ha细胞培养至长满培养瓶的90％时，倒掉培养基，用pbs溶液冲洗细胞；向上述培养瓶中加入2ml的胰酶溶液，左右倾斜培养瓶以确保胰酶溶液可以完全覆盖细胞，在显微镜下观察细胞完全变圆且从瓶底脱落，加入5ml的培养基终止消化；收集细胞悬液至15ml离心管中，1000rpm离心5min，离心后弃上清，以2ml培养基重悬细胞，用血小球计数板对细胞密度进行计数，将细胞密度调整至1
×
106个/ml，室温放置备用。
60.步骤四、将上述低吸附孔板的每个孔中加入100μl egm-2-mv培养基，并将孔板置于打印机上；
61.执行打印程序，向打印机墨盒中吸入200μl hbmec打印墨水，并按照预设好的程序向每孔打印2μl hbmecs打印墨水；
62.重新执行打印程序，向打印机墨盒中吸入200μl ha打印墨水，并按照预设好的程序向每孔打印2μl ha打印墨水；
63.再次执行打印程序，向打印机墨盒中吸入200μl hbvp打印墨水，按照预设好的程序向每孔打印2μl hbvp打印墨水；
64.将上述打印好的孔板放入37℃恒温培养箱中培养48h，形成血脑屏障类器官，即形成血脑屏障模型。
65.上述琼脂糖购自于sigma；
66.hbmec细胞、ha细胞、hbvp细胞均购自于sciencell；
67.egm-2-mv购自于lonza；
68.喷墨生物打印机购自于thermo公司。
69.实施例2
70.本发明实施例提供一种血脑屏障模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
71.步骤一、制备琼脂糖包被的低吸附孔板；
72.将琼脂糖0.5g溶于35ml去离子水中，微波加热至琼脂糖融化后，于103.2kpa、温度为121℃条件下30min，形成琼脂糖凝胶；
73.采用5ml移液枪吸取上述琼脂糖凝胶至培养皿中，然后用排枪分别迅速吸取45μl至96孔板的孔中；
74.将含有琼脂糖凝胶的96孔板水平、25℃放置15min使其固化，形成低吸附孔板；
75.步骤二、生物打印前准备工作：打印头置于体积浓度为75％酒精中灭菌30min，然后再将打印头置于紫外照射灭菌30min；打印机执行
‘
rountin’程序，对打印机的管道进行灭菌：设置打印体积为22μl及电磁微阀开放时间3000ms；
76.步骤三、分别配制人脑微血管内皮细胞(hbmec)生物墨水、人脑血管周细胞(hbvp)生物墨水和人星形胶质细胞(ha)生物墨水；
77.上述hbmec生物墨水中内皮细胞的细胞密度为0.8
×
106个/ml；
78.上述hbvp生物墨水中周细胞的细胞密度为0.8
×
106个/ml；
79.上述ha生物墨水中星形胶质细胞的细胞密度为0.8
×
106个/ml；
80.步骤四、将上述低吸附孔板的每个孔中加入80μl egm-2-mv培养基，并将孔板置于打印机上；
81.执行打印程序，向打印机墨盒中吸入200μl hbmec打印墨水，并按照预设好的程序向每孔打印2μl hbmecs打印墨水；
82.重新执行打印程序，向打印机墨盒中吸入200μl ha打印墨水，并按照预设好的程序向每孔打印2μl ha打印墨水；
83.再次执行打印程序，向打印机墨盒中吸入200μl hbvp打印墨水，按照预设好的程序向每孔打印2μl hbvp打印墨水；
84.将上述打印好的孔板放入37℃恒温培养箱中培养72h，形成血脑屏障类器官，即形成血脑屏障模型。
85.实施例2制备的血脑屏障模型的细胞活力高，也能表达血脑屏障相关的功能蛋白，能用于高通量的筛选，达到与实施例1基本一致的效果。
86.为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。
87.对比例1
88.本对比例提供一种血脑屏障模型的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
89.步骤一、制备琼脂糖包被的低吸附孔板；
90.上述低吸附孔板的制备方法如实施例1所述，不再赘述；
91.步骤二、分别配制人脑微血管内皮细胞(hbmec)生物墨水、人脑血管周细胞(hbvp)生物墨水和人星形胶质细胞(ha)生物墨水；
92.上述hbmec生物墨水、hbvp生物墨水和ha生物墨水的制备方法如实施例1所述，不再赘述；
93.步骤三、将上述低吸附孔板中加入100μl egm-2-mv培养基，并分别用移液枪吸取每种细胞悬液2μl至低吸附孔板中；将上述孔板放入37℃恒温培养箱中培养48h，形成血脑屏障类器官，即形成血脑屏障模型。
94.为了更好的说明本发明实施例提供的血脑屏障模型的构建方法的特性，下面将实施例1以及对比例1制备的血脑屏障模型进行检测。
95.试验例1喷墨生物打印机打印星形胶质细胞活力检测
96.参照实施例1中星形胶质细胞生物墨水的配制方法，将配制好的星形胶质细胞生物墨水分别采用喷墨生物打印机打印和手动移液枪接种相同数量的星形胶质细胞至低吸附孔板中(参照实施例1中的低吸附孔板的制备方法)。分别于接种后4小时，24小时进行活死细胞染色，其中钙黄绿素(购买自invitrogen，c3100mp)用来染活细胞，碘化丙啶(购买自sigma，p-4170)用来染死细胞，hoechst 33342用来染细胞核(购自invitrogen，h1399)，吸弃原培养基，并加入活死染色液染色30min，其中绿色荧光为活细胞，橘黄色荧光为死细胞，结果见图1，由图1可知，基于生物打印的星形胶质细胞能够保持较高活力，基于生物打印的与基于手动接种的星形胶质细胞活力没有明显差异。
97.试验例2血脑屏障类器官细胞活力检测
98.取实施例1和对比例1构建的血脑屏障模型进行活死细胞染色，其中钙黄绿素(购买自invitrogen，c3100mp)用来染活细胞，碘化丙啶(购买自sigma，p-4170)用来染死细胞。
99.分别将实施例1和对比例1的血脑屏障模型转移至1.5ml离心管中，吸弃原培养基，并加入活死染色液染色30分钟，其中绿色荧光为活细胞，橘黄色荧光为死细胞，结果见图2，由图2可知，本技术提供的喷墨打印以及对比例1提供的形成的血脑屏障类器官细胞活力没有差异。
100.试验例3血脑屏障类器官形态观察
101.取实施例1形成的血脑屏障模型于倒置显微镜中观察类器官形态，结果见图3，可见hbmec、ha、hbvp三种细胞形成了结构致密、大小均匀的细胞微球，直径为200μm左右。
102.取对比例1形成的血脑屏障模型于倒置显微镜中观察类器官形态，结果见图3，可见hbmec、ha、hbvp三种细胞形成的微球尺寸差异较大，且手动移液枪接种还会引入杂质，导致形成的血脑屏障有残缺，不能使用，均一性较差。
103.将实施例1以及对比例1构建的血脑屏障模型的直径进行分析，结果如图4所示，从图4中可以看出，本技术构建的细胞微球大小均匀，而对比例1构建的微球的直径差异巨大，均一性很差。
104.试验例4血脑屏障类器官功能检测
105.取实施例1中培养48小时后的血脑屏障类器官，进行紧密连接蛋白(zo-1)、p-糖蛋白(p-gp)及细胞外基质主要成分层粘连蛋白(laminin)免疫荧光染色，首先利用4％多聚甲醛固定15分钟；然后pbs洗两次，每次3分钟；含有0.1％吐温-20的pbs溶液透化15分钟，然后pbs洗两次，每次3分钟；5％牛血清白蛋白封闭1小时；加入含有zo-1、p-糖蛋白、laminin的一抗(1:100)4度过夜，pbs洗4次，每次5分钟；加入绿色荧光二抗，室温2小时，pbs洗4次，每次5分钟；dapi封片，采用operetta cls高内涵筛选系统拍照，结果见图5，图6和图7。从图中可以看出，实施例1提供的构建的血脑屏障类器官能表达血脑屏障相关的功能蛋白，由此说明通过实施例1提供的构建方法可以构建具有相关功能的血脑屏障类器官。
106.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。