人宫腔灌洗液来源的子宫内膜类器官的培养方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人宫腔灌洗液来源的子宫内膜类器官的培养方法。


背景技术：

2.类器官(organoids)：是指使用3d培养技术将来源于人类或动物组织的具有干细胞潜能的细胞进行培养，从而形成类似相应器官来源的组织结构，能够在体外模拟或再现一系列体内的生理病理过程，具有相对稳定的表型和遗传学特征。类器官培养技术现已成功适用于许多组织、器官，并被证明是研究器官正常发育过程和模拟疾病的有力工具。类器官能够用于预测药物效果，并为个体化再生医学开辟了新途径。
3.目前已经证明，子宫内膜类器官(eeo)可以为研究妊娠早期母胎相互作用以及探索子宫内膜异位症和子宫内膜癌等妇科疾病的病理生理学提供了一个有价值的模型。
4.既往eeo活检样本的获取方式主要是通过开腹手术或者宫腹腔镜手术，切除或骚刮子宫内膜组织获得的。虽然这种侵入性的取样方式可使得活检样本重复性好、成功率高，但也存在着诸多缺陷，主要包括以下几点：
5.(1)正常组织样本的获得途径受到医生临床经验和患者手术指征限制。
6.(2)通过手术获取的子宫内膜组织是一种侵入性操作，在一定程度上给患者或者捐献者带来伤害。同时侵入性操作不可避免的带来潜在的术中创伤、手术意外、术后感染等风险。
7.另一种获取方式是从月经血中提取，但因其保存条件严苛、样本数据不全等显性问题，也无法成为普适性操作方式。经血是子宫内膜在雌孕激素撤退后脱模剥脱后的组织和血液的混合物。虽然有文献报道了可以从中获取子宫内膜类器官，但经血来源的子宫内膜类器官受取样时间的限制，且该种方法不适用于停经或绝经的患者，导致难以进行全面研究。
8.因此，有必要设计一种相对无创且适用于多种场景的子宫内膜类器官的培养方法。我们通过相对无创的方法收集宫腔液中的脱落细胞和组织碎片，并从中培养子宫内膜类器官。


技术实现要素：

9.为解决上述问题，本发明公开了一种人宫腔灌洗液来源的子宫内膜类器官的培养方法和方法。本发明采用一种相对无创的方式减少在获得子宫内膜过程中患者受到的伤害，患者在宫腔灌洗液的提取过程中无需麻醉且很少出血；对于无法提取子宫内膜的一些病人，如薄型子宫内膜的患者等，我们可以用这种方案实现患者子宫内膜类器官的培养；宫腔灌洗液中培养出的子宫内膜类器官，可以后续用于妊娠早期母胎相互作用相关机制的研究或是对患者的药物筛选和治疗。
10.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
11.一种人宫腔灌洗液来源的子宫内膜类器官的培养方法，包括如下步骤：
12.步骤一、采用生理盐水灌洗宫腔得到宫腔灌洗液；
13.步骤二、富集宫腔灌洗液中的子宫内膜细胞并培养形成子宫内膜类器官；
14.步骤三、对子宫内膜类器官进行传代扩增；
15.步骤四、对子宫内膜类器官进行冷冻保存；
16.步骤五、对冻存子宫内膜类器官进行复苏和使用。
17.进一步的改进，所述步骤一包括如下步骤：
18.1.1准备物品：一次性人工授精管、5ml注射器、0.9％生理盐水、移植包、碘伏、15ml灭菌离心管；
19.1.2戴手套，将5ml注射器吸入2
±
1ml生理盐水；
20.1.3患者取截石位，常规消毒铺巾，将人工授精管缓缓送入宫底，退出约1cm，外接装有生理盐水的5ml注射器，缓缓将生理盐水推入宫腔，润洗宫腔后，将宫腔灌洗液缓缓吸出并收集到灭菌离心管，得到宫腔灌洗液；
21.1.4将宫腔灌洗液置于冰上，于1小时内进行步骤二。
22.进一步的改进，所述步骤二包括如下步骤：
23.2.1将装有宫腔灌洗液的离心管，于800g离心力下离心5min,弃掉上清液；
24.2.2将沉淀用pbs洗涤1-2次，去除宫颈粘液；
25.2.3将沉淀重悬于dmem/f12中，轻轻吹打沉淀，机械分离腺体碎片，800g离心5min，弃上清液；
26.将沉淀重悬于20％exm/80％matrigel基质胶中，取50ul均质悬浮液滴入预热的24孔培养板进行铺板，待基质胶凝固后，加入完全培养液,于37℃、5％co2培养箱中培养，每2-3天更换1次培养液。
27.进一步的改进，所述步骤三包括如下步骤：
28.3.1自培养箱中取出培养板，加入预冷的无酶、生长因子和血清的dmem/f12，使基质凝胶液化，使用移液枪收集所有类器官至15ml无菌离心管；
29.3.2向离心管中加入1x tryple消化液(gibco)使类器官于37℃下消化6-10分钟，期间需反复吹打；
30.3.3将消化后的溶液于4℃800g离心5min，弃上清，加入20％exm/80％matrigel基质胶重悬，得到均质悬浮液；
31.3.4取50μl均质悬浮液滴入预热的培养板进行铺板，待基质胶凝固后，加入完全培养液500ul，于37℃、5％co2中培养箱中培养，每2-3天更换1次培养液；传代时按照1:2至1:4的比例进行传代，取第3-6代的类器官用于冷冻保存或用于后续实验。
32.进一步的改进，还包括步骤四、对传代子宫内膜类器官进行冻存；
33.4.1将培养孔中的培养基替换为350μl的预冷细胞回收液，吹打eeo-matrigel混合物，并将培养皿置于冰上30分钟，使matrigel基质胶液化；
34.4.2用低吸附枪头将培养皿中的混合物收集入低吸附的15ml离心管中，手动轻轻上下移液80次以将子宫内膜类器官与基质胶分离，于800g下离心5分钟，使子宫内膜类器官沉淀；
35.4.3弃上清液，向离心管中加入1-2ml的预冷的dmem/f12培养基，手动轻轻上下移
液80次，破坏子宫内膜类器官的腺腔结构，加入4ml预冷的dmem/f12培养基，吹打混匀后于800g下离心5分钟；
36.4.4弃上清液，将沉淀物置于冰上3分钟；
37.4.5向离心管中加入0.8-1ml类器官冻存液，将类器官吹打混匀后转移至细胞冻存管内，在细胞冻存管上标记类器官的名称、患者的编号、日期、操作者信息，将冻存管转移至程序性冻存盒，于-80℃过夜，次日将细胞冻存管转移至液氮罐中长期冻存。
38.进一步的改进，所述步骤五包括如下步骤：
39.5.1从-80℃冰箱或液氮罐中取出冻存的子宫内膜类器官后，迅速置于37℃恒温水浴锅中快速振荡解冻；
40.5.2将类器官转移至15ml离心管中，加入3ml的dmem/f12培养基重悬类器官，于室温800g离心5分钟，弃上清；
41.5.3向沉淀中加入dmem/f12培养基，吹打均匀并于4℃800g离心5分钟，加入20％exm/80％matrigel基质胶重悬；
42.取50μl均质悬浮液滴入预热的24孔培养板进行铺板，待基质胶凝固后，加入完全培养液500ul,于37℃、5％co2中培养箱中培养，每2-3天更换1次培养液。
43.进一步的改进，还包括步骤六、检测子宫内膜类器官对性激素的反应性：
44.6.1将类器官分组后传代后培养3-4天，隔天更换1次培养基；
45.6.2第5和6天加入10nm雌激素处理处理2天，第7和8天加入如下激素：e2组加入10nm雌激素，ep组加入10nm雌激素和1um孕激素；epc组加入10nm雌激素和1um孕激素和10um camp；
46.6.3激素处理结束后，通过甲醛固定类器官，利用琼脂糖包埋切片后对类器官进行pas染色；
47.6.4激素处理结束后，通过trizol法分离提取；
48.6.5激素处理结束后，通过戊二醛固定类器官，用1ml注射器针头抽吸将类器官解离，利用扫描电镜检测类器官表面形态。
49.本发明的优点：
50.本发明技术方案带来的有益效果
51.(1)采用无创取样的方式减少在获得子宫内膜过程中患者受到的伤害，患者在宫腔灌洗液的提取过程中无需麻醉且很少出血。
52.(2)对于无法通过常规方法获取子宫内膜的一些病人，如薄型子宫内膜的患者等，我们可以用这种方案实现患者子宫内膜类器官的培养。
53.(3)宫腔灌洗液中培养出的子宫内膜类器官，可以后续用于妊娠早期母胎相互作用相关机制的研究或是对患者的药物筛选和治疗。
附图说明
54.图1a为本发明uf-eeo提取培养示意图。
55.图1b为eeo光镜图片；
56.图1c为uf-eeo光镜图片；
57.图1d为eeo腺上皮标志物epcam，cytokeratin-7(ck7)，e-cadherin的免疫荧光图；
58.图1e为uf-eeo腺上皮标志物epcam，cytokeratin-7(ck7)，e-cadherin的免疫荧光图；
59.图2为传代后uf-eeo光镜图片；
60.图3为冷冻复苏后uf-eeo的光镜图片；
61.图4为类器官激素处理前后的pas染色；
62.图5为类器官激素处理前后激素反应相关基因的表达检测；
63.图6为子宫内膜类器官拆解后的镜图。
具体实施方式
64.以下结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
65.实施例
66.一种人宫腔灌洗液来源的子宫内膜类器官的培养方法，包括如下步骤：
67.(1)宫腔灌洗液提取方法
68.①
准备物品：一次性人工授精管、5ml注射器、0.9％生理盐水、移植包、碘伏、15ml灭菌离心管；
69.②
戴手套，将5ml注射器吸入2
±
1ml生理盐水；
70.③
患者取截石位，常规消毒铺巾，将人工授精管缓缓送入宫底，退出约1cm,外接装有生理盐水的5ml注射器，缓缓将生理盐水推入宫腔，润洗宫腔后，将宫腔灌洗液缓缓吸出并收集到灭菌离心管，得到宫腔灌洗液；
71.④
将样本置于冰上，转送于实验室，于1小时内处理。
72.(2)宫腔灌洗液来源的人子宫内膜类器官(uf-eeo)的提取方法如图1a所示：
73.①
将装有宫腔灌洗液的离心管，于800g离心力下离心5min,弃掉上清液；
74.②
将沉淀用pbs洗涤数次，去除宫颈粘液；
75.③
将沉淀重悬于dmem/f12中，轻轻吹打沉淀，机械分离腺体碎片，800g离心5min，弃上清液；
76.④
将沉淀重悬于dmem/f12中，轻轻吹打沉淀，机械分离腺体碎片，1000g离心5min，弃上清液；
77.⑤
将沉淀重悬于20％exm/80％matrigel基质胶中，取50ul均质悬浮液滴入预热的24孔培养板进行铺板，待基质胶凝固后，加入完全培养液,于37℃、5％co2培养箱中培养，每2天更换1次培养液。
78.⑥
如图1b-e中所示，eeo与uf-eeo在光镜下的形态无差异，且两者同样表达腺上皮标志物epcam，cytokeratin-7(ck7)，e-cadherin。
79.(3)uf-eeo的传代
80.人子宫内膜腺体细胞会在基质胶中形成球型腺腔样结构，需7-10天进行传代，传代时按照1:2至1:4的比列进行传代(根据生长效率)，3-6代的类器官用于做后续实验(如图2)。
81.①
培养箱中取出24孔板，加入预冷的dmem/f12(无酶、生长因子和血清)使基质凝胶液化，使用移液枪尽量收集所有类器官至15ml无菌离心管；
82.②
加入1x tryple(gibco)使类器官于37℃解离6-10分钟，期间需反复吹打；
83.③
4℃下800g离心5min，弃上清，加入20％exm/80％matrigel基质胶重悬，得到均质悬浮液；
84.④
取50μl均质悬浮液滴入预热的24孔培养板进行铺板，待基质胶凝固后，加入完全培养液500ul,于37℃、5％co2中培养箱中培养，每2-3天更换培养液。
85.(4)uf-eeo的冻存
86.①
将培养孔中的培养基替换为350μl的预冷细胞回收液,吹打eeo-matrigel混合物，并将培养皿置于冰上30分钟，使matrigel基质胶液化；
87.②
用低吸附枪头将培养皿中的混合物收集入低吸附的15ml离心管中，手动轻轻上下移液80次以将子宫内膜类器官与基质胶分离，于800g下离心5分钟，使子宫内膜类器官沉淀；
88.③
弃上清液，向离心管中加入1-2ml的预冷的dmem/f12，手动轻轻上下移液80次，破坏子宫内膜类器官的腺腔结构，加入4ml预冷的dmem/f12，吹打混匀后于800g下离心5分钟；
89.④
弃上清液，将沉淀物置于冰上3分钟；
90.⑤
向离心管中加入0.8-1ml类器官冻存液，将类器官吹打混匀后转移至细胞冻存管内，在细胞冻存管上标记类器官的名称、患者的编号、日期、操作者信息，将冻存管转移至程序性冻存盒，于-80℃过夜，次日将细胞冻存管转移至液氮罐中长期冻存。类器官冻存液成分：10％dmso+90％血清。
91.(5)uf-eeo的复苏
92.①
从-80℃冰箱或液氮罐中取出冻存的类器官后，迅速置于37℃恒温水浴锅中快速振荡溶解；
93.②
转移至15ml离心管中，加入3ml的dmem/f12重悬类器官，于室温800g离心5分钟，弃上清；
94.③
向沉淀中加dmem/f12培养基，吹打均匀并于4 c下800g离心5分钟，弃上清，20％exm/80％matrigel基质胶重悬；
95.④
取50μl均质悬浮液滴入预热的24孔培养板进行铺板，待基质胶凝固后，加入完全培养液500ul,于37℃、5％co2中培养箱中培养，每2-3天更换1次培养液(如图3)。
96.(6)uf-eeo对激素的反应检测
97.1.将uf-eeo和eeo分别传代后培养3天，然后使用雌孕激素和camp序贯处理4天。其中雌激素终浓度为10nm、孕激素为1um、camp为10um。e2为雌激素组，连续处理4天。e2+mpa+camp为雌激素处理2天，然后雌激素+孕激素+camp处理2天。
98.2.激素处理完毕后将类器官通过琼脂包埋后切片，并用pas染色检测类器官的分泌功能的变化。结果可见激素序贯处理后的uf-eeo可见分泌期子宫内膜样改变(如图4)。
99.3.激素处理完毕后收集类器官，通过trizol法提取类器官rna，进行实时荧光定量pcr检测激素反应相关基因(spp1、paep、17hsdβ2)的表达变化。结果可见子宫内膜激素反应相关基因在激素序贯处理后表达显著增加(如图5)。
100.4.将雌孕激素序贯处理完毕后的类器官用戊二醛固定，然后用1ml注射器针头抽吸，将类器官打碎后包埋，进而用扫描电镜检测类器官表面形态。电镜图显示类器官表面有微绒毛和胞饮突(如图6)。
101.尽管本发明的实施方案已公开如上，但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里所示出与描述的图例。