一种用于猪基因组定点整合外源基因的安全位点及用其构建猪育种群方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种用于猪基因组定点整合外源基因的安全位点及用其构建猪育种群方法。


背景技术：

2.自从1980年世界首例利用显微注射技术生产转基因小鼠问世以来(gordon1980)，转基因动物育种技术已经发展30多年，在基因操作水平产生了原核注射技术，胞浆注射(isci)技术，体细胞克隆转基因技术(scnt)等；基因转移技术出现了磷酸钙沉淀法、电转移法和脂质体转染法、逆转录病毒介导的基因转移、原始生殖细胞技术、以及主动整合转座子系统技术、但其介导的转基因整合方式是随机，很难获得遗传背景一致的不同家系，因此不利于转基因新品系的培育。
3.近年来，随着zfns和talens、crispr/cas9等基因编辑技术突飞猛进，在基因替换、修复、越来越精确、高效，也提高了基因同源重组的效率，这些编辑技术与传统转基因技术整合形成定点整合技术，提高定点整合转基因的效率，有利于构建转基因整合位点一致的新品种。定点整合转基因技术是在动物基因组靶位点产生dna双链断裂(double-strand break，dsb)后，通过同源重组修复(homologous-directed repair，hdr)机制，或微同源重组机制(mmej)，或单链寡核苷酸(ssodn)介导的重组修复机制，将外源基因整合到特定靶位点。尽管基因编辑工具为定位点插入外源基因提供了dsb条件，但随后的hdr效率仍然十分低下，特别是猪原代细胞(李国玲,钟翠丽,莫健新,等.动物基因组定点整合转基因技术研究进展[j].遗传,2017, 039(002):98-109.)。此外，常用的外源表达载体，如乳腺生物反应器(》25kb)、唾液腺生物反应器(》20kb)及多基因共表达载体等，需整合的dna片段都非常大，仍存在同源重组效率低的问题。此外，基因编辑技术也增加了未知的脱靶的风险，导致胚胎发育障碍、怀孕率低、产仔少、畸形和死胎增多，获得转基因动物存在未知原因的生长迟缓，增加了育种难度和成本。
[0004]
除了基因编辑工具的脱靶风险问题外，外源基因的插入也会影响靶位点基因、侧翼邻近基因的表达以及染色质状态，进而对胚胎发育或个体健康产生不良影响。为了外源基因插入安全性及正常表达，开发动物基因组上安全位点是一项重要内容，安全位点为外源基因提供一个安全可靠的停泊“港口(safe harbor)”，使得外源基因既可以稳定高效表达，又对细胞生长，胚胎发育及个体健康无副作用。目前已经有多个可用于哺乳动物外源基因插入的基因组safeharbor被发现并应用到人、小鼠、大鼠、兔子可调控或可逆基因过表达，例如：aavs1、ccr5、 hprt、h11、col1a1、tigre等。
[0005]
其中rosa26和h11位点也被用于猪基因组安全位点，但发明人研究团队前期在研究猪 rosa26位点时发现，该位点可用于大部分基因及其调控区的定点插入，然而用其整合大片段基因时，非常容易发生断裂或重组，无法获得携带完整转基因片段的转基因动物。h11位点所在的eif4enif1与drg1两个基因狭小的区间(5kb)，外源基因插入后影响內源基
因表达的风险很小，在猪上有报道可以支持长达9kb外源基因插入，并能在细胞，胚胎和动物各组织中表达。但其载量是否能够满足更大片段的整合尚未可知。此外，研究发现(pmid:32789000)aavs1 安全位插入报告基因在不同hipsc细胞克隆间表达和沉默存在较大的变异，影响基因表达稳定性。
[0006]“低粮耗”和“低排放”始终是养猪业孜孜追求的目标，关乎全国粮食安全和生态安全，因此培育节粮环保型猪新品种对我国养猪业可持续发展具有重要战略价值。前期研究中，前期发明人研究团队已利用piggybac转座子介导的转基因技术成功制备了共表达葡聚糖酶-木聚糖酶-植酸酶的转bexa基因猪育种模型，该片段整合在猪cep112基因内含子中，与普通猪相比，获得相同的生产性能，其公猪粪氮、粪磷、粪钙含量分别减少了17.17％、51.95％和72.65％；其母猪粪氮、粪磷和粪钙含量分别减少了15.10％、52.42％和67.15％，极大缓解了养猪环境压力。这些环保猪不仅具有较高生态价值，也有望为养殖户带来巨大的经济效益。研究显示，与饲喂相同饲料的普通猪比较，该猪比普通猪日增重(adg)提高20％左右，饲料转化率(fcr)下降15％左右，饲养周期缩短约30天，平均每头可节约饲料26～33kg，相当于节约78～99元/ 头的饲料成本。环保猪符合政府倡导低碳、绿色、环保理念，市场前景十分广阔。
[0007]
节粮环保型转基因育种生产应用，还需构建6～8个无血缘关系的、整合在相同基因座位上的系祖，用于组建育种群体，为解决节粮环保猪群体快速构建技术问题，发明人研究团队又建立了大片段基因定点整合技术，利用crispr-cas9系统将上述转基因片段分别整合至cep112 位点，psp-tc末端终止密码子(termination codon)处位点及rosa26位点(第一内含子)，前期试验结果显示：cep112位点虽然能将上述转基因高效插入猪基因组并正常表达，但克隆效率低、产仔少、难成活缺点，用该位点构建育种群体成本较高；psp-c末端位点虽然克隆效率高，仔猪健康正常，但目的基因无法表达；rosa26位点是学界公认的安全位点，但用其构建的节粮环保猪同源重组载体易断裂，基因整合过程中存在不明原因的缺失。现有技术将表达葡聚糖酶 (bg17a和eg1314)，木聚糖酶(xynb)、植酸酶(appa)的多顺反子bexa (bg17-eg1314-xynb-appa)定点整合到猪腮腺蛋白基因psp(parotid secretory protein，psp) 终止密码子上游处，使外源基因与内源基因串联表达。结果显示，对psp基因终止密码子处编辑，虽然无论杂合子或纯合子突变均不影响转基因猪细胞和个体存活，出生仔猪达到2.11头/ 窝，但是克隆效率低，仅仅为0.87％(获得克隆仔猪数/移植胚胎数)，其克隆效率仅与rosa26 位点克隆效率0.81％相当，因此严重影响了转基因猪市场化。亟需开发一个新的自主知识产权的安全位点，用于构建节粮环保猪新品种育种群体。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于猪基因组定点整合外源基因的安全位点及用其构建猪育种群方法，本发明开发猪基因组上开发了一种新的安全位点pspd，该位点具有较大承载能力，能够保持外源基因调控区独立性发挥功能并使外源插入基因的高效表达，具有较高打靶效率，定点整合效率和克隆效率，对外源基因和动物自身均具有较高的安全性，可用于转基因动物新品种培育。其主要用于生物育种，培育具有重大经济价值的转基因动物新品种。
[0009]
本发明公开了一个可供外源大片段基因定点整合的猪基因组新安全位点及其应
13421，gcf_000003025.6))(seq id no：159)，其位于bpifa2(psp)终止密码子下游500bp至 bpifa3基因起始密码子上游3000bp。该位点位于开放性染色质区域，区内没有其他基因，也未发现其他转录本存在，间隔区长36690bp，整个区间gc含量44.72％，非常有利于各类编辑工具切割、外源基因同源重组插入及表达。
[0025]
优选地，所述安全位点基因片段位于猪17号染色体36,704,009～36,736,679。
[0026]
优选地，所述基因片段如seq id no：1～2，seq id no：9～124、seq id no：129～139、 seq id no：3～4所示序列中的一段或几段的组合。
[0027]
一种用于哺乳动物基因组定点整合外源基因的同源重组载体的同源臂，基于所述安全位点基因片段设计的同源臂，其核苷酸序列如seq id no：1和2所示，所述整合外源基因基于同源重组
[0028]
一种同源重组载体，同源重组载体包括：上游同源臂、插入片段和下游同源臂，所述上游同源臂其核苷酸序列如seq id no：1所示，所述下游同源臂其核苷酸序列如seq id no：2 所示，
[0029]
优选地，所述同源重组载体为含有cre-loxp重组酶系统的同源重组载体，所述同源重组载体还含有筛选标记基因，其中所述筛选标记基因能够利用cre重组酶删除。
[0030]
优选地，所述筛选标记基因为egfp和/或neo。
[0031]
所述的同源臂和/或所述同源重组载体在哺乳动物基因组定点整合外源基因或制备哺乳动物基因组定点整合外源基因试剂盒的应用中的应用。
[0032]
一种靶向所述的安全位点基因片段的sgrna，其核苷酸序列如seq id no：9～124、seqid no：129～139任一所示。
[0033]
一种crispr/cas9表达载体，包括所述的sgrna序列。
[0034]
优选地，还含有cas9蛋白的编码和crispr结构序列。
[0035]
一种猪基因组整合外源基因的重组细胞，转化或转染有所述的crispr/cas9表达载体和/ 或所述的同源重组载体。
[0036]
一种用于外源基因整合到猪基因组的组合物，含有所述的同源臂、所述同源重组载体、所述的sgrna、所述的crispr/cas9表达载体、或所述的重组细胞中的一项或几项。
[0037]
所述的安全位点基因片段、所述的同源臂、所述同源重组载体、所述的sgrna、所述的 crispr/cas9表达载体、或所述的重组细胞中的一项或几项在猪特异性定点整合基因编辑或制备猪特异性定点整合基因编试剂盒的应用中的应用。
[0038]
一种猪基因组定点整合外源基因的转基因的方法，利用所述的安全位点基因片段、所述的同源臂、所述同源重组载体、所述的sgrna、所述的crispr/cas9表达载体、或所述的重组细胞中的一项或几项。
[0039]
一种节粮环保猪育种群构建方法，利用所述的安全位点基因片段、所述的同源臂、所述目标基因同源重组载体、所述的sgrna、所述的crispr/cas9表达载体、所述的重组细胞，所述的转基因杂合子或纯合子群体构建方法中的一项或几项。
[0040]
一种节粮环保猪的构建方法，利用所述的同源臂、所述同源重组载体、所述的sgrna、所述的crispr/cas9表达载体、或所述的重组细胞中的一项或几项，将多顺反子bexa整合入猪基因组，所述多顺反子bexa的核苷酸序列如seq id no：158所示。
[0041]
优选地，将所述的crispr/cas9表达载体和所述同源重组载体共转染复苏后的猪
胚胎成纤维细胞，转染后的细胞极限稀释铺板，培养12到15天后，筛选阳性克隆细胞团，去除筛选标记基因后的细胞作为核移植供体细胞，利用体克隆转移技术构建转基因胚胎，手术移植重构胚胎到代孕母猪体内，制备得到转基因克隆猪，即为节粮环保猪，所述所述同源重组载体的插入片段为所述多顺反子bexa。
[0042]
更优选地，所述筛选阳性克隆细胞团包括筛选标记基因表达阳性和多顺反子bexa插入阳性；
[0043]
更优选地，使用lonza电穿孔转染系统中a-033程序进行转染。
[0044]
更优选地，使用核苷酸序列如seq id no：144到149所示的引物进行多顺反子bexa的阳性筛选。
[0045]
更优选地，所述同源重组载体为含有cre-loxp重组酶系统的同源重组载体，所述同源重组载体还含有筛选标记基因，其中所述筛选标记基因能够利用cre重组酶删除，鉴定多顺反子 bexa的整合情况后，利用cre重组酶删除cre重组酶删除。
[0046]
一种节粮环保猪育种群构建方法，利用所述的安全位点基因片段、所述的同源臂、所述同源重组载体、所述的sgrna、所述的crispr/cas9表达载体、或所述的重组细胞中的一项或几项。
[0047]
优选地，包括如下步骤：
[0048]
s1、从选择不少于6头三代以内无共同祖先的公猪作为公猪系祖；从母猪中选择相同头数三代以内无共同祖先的母猪作为母猪系祖，将选择的母猪系祖作为以上公猪系祖的配种对象；
[0049]
s2、对以上母猪系祖和公猪系祖进行一一选配，待配种的母猪系祖与公猪系祖之间3代内没有共同祖先，怀孕25到35天天龄时，取出胚胎；
[0050]
s3、用dmem冲洗三次后，消化至组织蓬松，加入血清铺板，过夜后，加入含有10到14％ (v/v)fbs的高糖dmem培养液中维持培养2～3天，获得每对母猪系祖与公猪系祖的后代的胚胎成纤维细胞(pef)，并对性别进行鉴定；
[0051]
s4、每对母猪系祖与公猪系祖的后代的胚胎成纤维细胞分别按照权利要求12或13所述构建方法构建节粮环保猪，生产不少于6个家系的转基因克隆公猪和母猪，作为的f0代转基因猪群体；
[0052]
s5、将每个家系的f0代转基因克隆公猪和母猪，分别与其他家系的f0代转基因公猪或母猪交配，扩繁得到f1代节粮环保转基因猪，选择其中转基因猪纯合子(+/+)公猪和母猪，组建得到节粮环保猪育种核心群。
[0053]
优选地，步骤s3中，使用核苷酸序列如seq id no：154到157所示引物对性别进行鉴定。
[0054]
优选地，步骤s3中，过夜后，加入含有12％(v/v)fbs的高糖dmem培养液中维持培养2～3天。
[0055]
优选地，步骤s4中，雌性和雄性胚胎按1：1数量混合后，移植到4～6头代孕母猪输卵管内。
[0056]
优选地，步骤s4中，公猪系祖和母猪系祖均为6只
[0057]
优选地，步骤s5中，使用核苷酸序列如seq id no：150到153所示引物扩增，选择其中转基因猪纯合子，仅核苷酸序列如seq id no：152到153所示引物扩增有条带，为转基因
猪纯合子
[0058]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0059]
1)本发明发现pspd安全位点基因片段在bpifa2(psp)基因和bpifa3基因中间，区域间隔长达37kb(h11位点仅有5kb间隔区，rosa26和cep112位点位于内含子中)，位于开放染色质区，与现有的报道安全位点相比，非常有利于各类编辑工具的切割；有利于大片段基因的定点插入(包括hdr、mmej、ssa、nhej等技术)；该安全位点有利于外源基因的表达，并保持其组织特异性不受内源基因影响。
[0060]
2)与现有技术相比，本发明获得pspd安全位点具有较高的定点整合效率(效率高于 rosa26、cep112和h11)，显著降低定点整合细胞系筛选的难度，节约细胞筛选时间和成本。
[0061]
3)与现有技术相比，本发明获得安全位点具有更高的克隆效率，用其制备克隆动物，具有更高的怀孕率，窝均总仔和健仔，表明其不受脱靶等负面影响，非常有利于构建转基因新品种育种群。
[0062]
4)与现有技术相比，本发明获得安全位点在与插入片段同源重组过程中，能保证插入片段基因的完整性，而rosa26位点较容易出现断裂和重组。
[0063]
该pspd安全位点与以往安全位点(rosa26、cep112和h11)相比，定点整合效率高，克隆效率高，可供大片段基因插入和表达，对猪和胚胎发育无不良影响，具有较高的安全性，是猪生物育种理想的安全位点。
[0064]
5)与现有育种方法相比，本发明培育转基因新品种的方法，克服传统选育耗时长，进展慢的缺点，将有效的外源基因引入现有猪育种群，构建具有特殊功效的猪新育种群仅需2个世代就可以获得6个以上家系、基因型完全一致转基因纯合子新群体。。
附图说明
[0065]
图1为预测的安全位点pspd位点位置及其所处染色体环境。
[0066]
图2为pspd所在区域核小体形成能力预测。
[0067]
图3为psp基因及pspd区域gc％分析结果。
[0068]
图4为利用softberry预测pspd位点区域的疑似启动子和增强子区域。
[0069]
图5为利用promoter-2.0在线软件预测pspd位点的疑似启动子区(psp基因3＇utr下游)。
[0070]
图6为pspd位点区域顺式调控元件polyt和polya预测结果。
[0071]
图7为pspd位点区域(chromosome 17:36,699,989～36,736,679)可供外源基因插入潜在 sgrna位点。
[0072]
图8为pspd-sgrna-cas9靶位点突变效率的t7ei酶切分析。
[0073]
图9为ki-pspd-npsp-bexa载体构建技术路线。
[0074]
图10为pspd-la、pspd-ra扩增电泳图；m为dna marker，pspd-la是350bp，pspd-ra 是3511bp。
[0075]
图11为inf-pspd-la、inf-pspd-ra扩增电泳图；m为dna marker，inf-pspd-la是380bp， inf-pspd-ra是3541bp。
[0076]
图12为筛选标志(neogfp)扩增电泳图；m为dna marker，pcr目的条带为2627bp。
[0077]
图13为筛选标志同源臂(inf-neogfp)扩增电泳图；m为dna marker，pcr目的条带为 2638bp。
[0078]
图14为cep112-npsp-bexa载体(为中国专利cn201711477805.5的超螺旋供体质粒 cep112-la340ra3219)fastdigest noti和fastdigest smai双酶切；m为dna marker，nc 为cep112-npsp-bexa载体(26310bp)，sample为cep112-npsp-bexa双酶切载体，酶切后两段分别为25941bp和373bp。
[0079]
图15为pspd-la-npsp-bexa菌液pcr鉴定；m为dna marker，pcr目的条带为1076bp。
[0080]
图16为pspd-la-npsp-bexa载体fastdigest spei酶切；m1为dna marker 15k，m2为 dna marker 2k，nc为pspd-la-npsp-bexa载体(26291bp)，zt为pspd-la-npsp-bexa 酶切载体，酶切后两段分别为25605bp和690bp。
[0081]
图17pspd-la neogfp-npsp-bexa菌液pcr鉴定；m为dna marker，pcr目的条带为 1564bp。
[0082]
图18为pspd-la neogfp-npsp-bexa载体fastdigest xhoi酶切；m为dna marker 15k， nc为pspd la neogfp-npsp-bexa载体(28252bp)，zt为pspd-la-npsp-bexa酶切载体，酶切后两段分别为23152bp和5103bp。
[0083]
图19为ki-pspd-npsp-bexa菌液pcr鉴定；m为dna marker，pcr目的条带为984bp。
[0084]
图20为ki-pspd-npsp-bexa载体酶切；m1为dnamarker 15k，m2为dna marker 8k， m2为5kb dna marker，m2为2kb dna marker，nc1和nc 2为ki-pspd-npsp-bexa载体 (26687bp)，s1和s2为ki-pspd-npsp-bexa酶切载体，用fastdigest sgsi、fastdigest snabi 和fastdigest smai酶切时，目标片段的长度分别为：13007bp、8735bp、4103bp及842bp。当用fastdigest kpn2i、fastdigest bshti、fastdigest smai酶切时，目标片段的长度分别为：10576bp、7644bp、6978bp及1499bp。
[0085]
图21为ki-pspd-npsp-bexa载体图谱。
[0086]
图22为pspd位点定点整合bexa的转基因的单克隆细胞系荧光筛选。
[0087]
图23为pspd位点定点整合bexa的转基因的细胞筛选la和ra整合鉴定pcr图；注：上图为筛选的杜洛克公猪细胞系5f1，下图为筛选的杜洛克母猪细胞系ab17-046400。
[0088]
图24为pspd位点整合外源片段测序结果。
[0089]
图25为pspd定点整合bexa的转基因猪。
[0090]
图26为pspd位点克隆猪pcr检测。
[0091]
图27为pspd位点ki转基因克隆猪目标基因在各组织的相对表达量。
[0092]
图28为克隆猪腮腺、颌下腺葡聚糖酶活。
[0093]
图29为克隆猪腮腺、颌下腺纤维素酶活。
[0094]
图30为克隆猪腮腺、颌下腺木聚糖酶活。
[0095]
图31为克隆猪腮腺、颌下腺植酸酶活。
[0096]
图32为h11-npsp-bexa载体构建技术路线。
[0097]
图33为杜洛克猪pef细胞系性别鉴定结果。
[0098]
图34为转基因细胞系筛选和鉴定结果。
[0099]
图35为节粮环保猪育种群构建和繁育方法。
[0100]
图36为f1代转基因猪基因型鉴定结果(部分猪鉴定结果)。
[0101]
图37为f1代节粮环保猪纯合子育种群
具体实施方式
[0102]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0103]
实施例1pspd安全位点基因片段的确定
[0104]
一、pspd位点
[0105]
在ncbi上搜索ensembl(猪基因组测序联盟(sgsc)sscrofa11.1(ncbi project 13421，gcf_000003025.6))和ncbi数据库中分别检索psp基因，发现猪17号染色体上psp基因终止密码子下游168bp至bpifa3基因启动子(上游3000bp)(chromosome 17:36,699,989～ 36,736,679)，命名为pspd位点，见图1，核苷酸序列如seq id no：159所示。
[0106]
pspd位点区域内没有其他基因，也未发现其他转录本存在，间隔区长36690bp。
[0107]
二、pspd位点的染色质可及性分析
[0108]
1、实验方法
[0109]
染色质可及性(chromatin accessibility)是核内大分子能够物理接触染色质化dna的程度，染色质可及性反映了转录因子tf结合和遗传位点总的调节潜力，封闭染色质(closed chromatin) 核小体形成能力强，核小体占据率高，而宽松染色质(permissive chromatin)核小体占据率低，有利于转录因子(tf)结合，调控基因转录。
[0110]
利用recon progra(http://wwwmgs.bionet.nsc.ru/mgs/programs/recon/)在线软件，对pspd 位点区域(猪chromosome 17:36,699,989-36,736,679)进行核小体占据能力预测。
[0111]
2、实验结果
[0112]
通过核小体形成能力预测染色体可及性，评估pspd位点区域内染色质开放程度，结果如图2所示，pspd位点区域内存在较多核小体占据弱的区间，推测pspd位点位于较开放的染色质区域，有利于基因编辑、外源基因的插入和转录。
[0113]
三、预测pspd位点gc含量及分布
[0114]
1、实验方法
[0115]
利用金斯瑞提供gensmart
tm codon optimization软件，预测pspd位点gc含量及分布。
[0116]
2、实验结果
[0117]
结果见图3，经预测，整个pspd位点区域内gc含量44.72％，几乎不存在大于70％的区域，非常有利于外源基因同源重组操作。gc含量《30％，仅在psp基因下3＇utr下游0～4020bp 处分布gc含量gc含量《30％，给予剔除，剩余区域为(chromosome 17:36,704,009～ 36,736,679)。
[0118]
三、pspd位点启动子和增强子以及转录起始位点的预测
[0119]
1、实验方法
[0120]
pspd区不存在转录的基因区，但是否存在潜在的调控序列仍未知，本发明利用
softberry 在线软件对pspd区域可能存在启动子和增强子调控序列进行预测 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml？topic＝fprom&group＝programs&subgroup＝promoter)。
[0121]
同时利用promoter-2.0在线软件(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？promoter-2.0) 对脊椎动物polii启动子转录起始位点进行预测。
[0122]
2、实验结果
[0123]
结果如图4所示，经softberry在线软件预测，显示潜在启动子和增强子主要分步在pspd 位点的7005bp～35112bp区域(psp基因3＇utr下游)，为避开潜在调控序列对插入基因的影响，本发明选取pspd 4020～7005bp区间(psp基因3＇utr下游)为外源基因插入安全区域。
[0124]
结果如图5所示，经promoter 2.0预测，显示pspd位点的2400bp～15000bp区间(psp 基因3＇utr下游)没有预测到高可信度的起始位点，说明该区间不存在转录区，插入基因对内源基因干扰风险较小。
[0125]
四、pspd位点顺式作用元件ploya和ployt的预测
[0126]
1、实验方法
[0127]
利用金斯瑞gensmart codon optimization在线顺式作用元件预测ploya和ployt。
[0128]
2、实验结果
[0129]
由于rna聚合酶iii启动子(pol iii)多采用ployt终止子，因此，应避开ployt上游600bp 的区域，以免破坏内源mirna或sirna的转录，一般其下游区域不受影响。预测结果如图6 所示。进一步缩小安全位点区域，将pspd位点区域进一步缩小为psp基因3’utr下游4020bp～ 5000bp区间(chromosome 17:36,704,009～36,704,989)和psp基因3’utr下游5637～7005bp (chromosome 17:36,705,626～36,706,994)。
[0130]
综合以上的结果，选择psp基因3’utr下游4020～5000bp(即chromosome 17:36,704,009～ 36,704,989，核苷酸序列如seq id no：3所示)和psp基因3’utr下游5637～7005bp (chromosome 17:36,705,626～36,706,994，核苷酸序列如seq id no：4所示)两个区域作为 pspd安全位点基因片段，由于启动子和调控原件预测准确性较差，还将psp基因3’utr下游 168bp～36858bp(即chromosome 17:36,699,989～36,736,679，核苷酸序列如seq id no：159 所示)纳入pspd安全位点基因片段的范围，在这个范围内，发现一些高效sgrna靶点(seqid no：9～124和seq id no：129～139)，其部分可供外源基因插入潜在sgrna位点分部见图7。进一步，在的pspd区域侧翼，仍发现一些高效sgrna靶点(seq id no：5～8和seqid no：125～128)，不排除其仍能作为安全位点的潜力，其部分可供外源基因插入潜在sgrna 位点分部见图7。以上所有供插入的靶点及序列见表1。
[0131]
表1：
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139][0140]
实施例2高效靶向腮腺分泌蛋白pspd sgrna获得
[0141]
一、实验方法
[0142]
1、crispr/cas9表达系统构建
[0143]
1)猪pspd基因区靶位点选择
[0144]
从数据库genbank上下载猪腮腺分泌蛋白psp的基因组序列，针对psp基因3’utr下游4020～5000bp(即chromosome 17:36,704,009-36,704,989)和psp基因3’utr下游5637～7005bp(chromosome 17:36,705,626-36,706,994)，使用在线网站http://crispr.mit.edu/挑选评分较高的sgrnas作为候选sgrna序列，候选sgrna序列信息见下表2。
[0145]
表2猪pspd位点的sgrna序列信息
[0146]
[0147][0148]
2)sgrna oligo退火
[0149]
设计好的后续sgrna和对应的互补序列分别加上与bbs i线性化的px330质粒互补的粘性末端，合成对应的oligo，oligo序列见表3。
[0150]
表3猪pspd位点sgrna的oligo序列
[0151]
[0152][0153]
配制oligo退火体系：正反向引物各4.5μl，加入1μl 10
×
t4 ligation buffer。
[0154]
退火程序为：95℃5min，10℃1min；95℃5min，10℃1min；95℃5min，10℃3min 获得的双链grna可置于-20℃冰箱保存备用。
[0155]
3)crispr/cas9表达载体的构建
[0156]
根据下表4的酶切反应体系，将px330载体线性化。在37℃酶切1h，利用1％的琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切下8462bp处的条带，用dna琼脂糖凝胶回收试剂盒e.z.n.a.rtissuedna kit的回收线性化的cas9表达骨架，保存于-20℃冰箱备用。
[0157]
表4 px330载体骨架酶切反应体系
[0158][0159]
参考t4 dna ligase说明书配制连接反应体系(表5)，于16℃恒温热台上连接30min。取 4μl连接产物加入trans t1受态细胞，轻轻混匀。随后冰浴30min，42℃热激30s，加入500μl 不含抗生素的lb培养基，在37℃，220rpm，恒温摇床上复苏1h。取200μl菌液涂在含有氨苄青霉素的la固体培养皿上，置于37℃恒温培养箱内过夜培养(12～16h)。
[0160]
表5 t4 dna ligase反应体系
[0161][0162]
等菌落长起后，挑取单克隆菌接种于500μl相应抗性lb培养基中，摇床培养2h。利用上游引物hu6-f：gagggcctatttcccatgatt与下游对应sgrna反向引物进行菌液pcr 鉴定含有sgrna序列的阳性菌落，从挑选的阳性菌落中取50μl送测选择hu6-f为上游引物测序验证，测序正确的菌落进行扩大培养，利用去内毒质粒抽提试剂盒e.z.n.a.
tm
endo-freeplasmid mini kitⅱ抽提质粒，分别制备得到pspd-sgrna1-cas9到pspd-sgrna11-cas9，保
存于-20℃冰箱备用。
[0163]
2、高效sgrna筛选
[0164]
1)杜洛克公猪胚胎成纤维细胞的复苏及培养
[0165]
将冻存的杜洛克公猪胚胎成纤维细胞细胞从液氮罐中取出，在37℃水浴锅中迅速解冻。将解冻后的细胞悬液加入9ml预热的15％fbs的dmem完全培养基中摇匀，接种到10cm 的细胞培养板，置于38.5℃，5％co2细胞培养箱培养。6h后当细胞贴壁，弃去上层培养液重新加入新的10ml 15％fbs的dmem完全培养基，置于培养箱内继续培养。当细胞汇合度达到 80-90％时，去除dmem培养基，使用2ml dpbs清洗2次，加入1ml 0.05％胰蛋白酶消化液消化细胞，可置于培养箱内消化1～2min，显微镜下观察，待细胞回缩变明亮后，加入2ml 完全培养基终止消化，用移液枪轻轻把细胞吹打下来，转移到15ml离心管中，在离心机内以 90g离心5min，弃去上层培养液，加入4ml完全培养基重悬细胞，各取出1ml接种到新的10cm 培养皿中，加入9ml完全培养基，置于细胞培养箱中继续培养，待细胞回合达到80％进行电穿孔转染。
[0166]
(2)细胞电转染
[0167]
细胞汇合度达到80％～90％时，使用0.05％trysin-edta消化。终止消化的细胞进行计数，吸取含有1
×
106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90g离心5min，弃去上层培养液，加 1mlopti-mem
tm i reduced serum medium冲悬细胞，90g离心5min，弃去上层培养液，参考 amaxa basic nucleofector kit for primary mammalian fibroblasts说明书配制电转液，每个反应82 μl的basic nucleofector
tm solution和18μl的supplement，再加入12μg的pspd-sgrna-cas9 质粒(pspd-sgrna1-cas9到pspd-sgrna11-cas9)混匀后移入电转杯中进行电转，使用电转仪nucleofectortm 2b，转染程序为a-033。电转后立即将电转杯中所有细胞转移至6孔板(15％ fbs完全培养基2ml/孔)，37℃、5％co2培养箱培养。48h后把细胞消化下来，利用dna 抽提试剂盒e.z.n.a.
rt
tissue dna kit抽提细胞的基因组dna，于-20℃冰箱中保存备用。
[0168]
(3)pspd sgrna靶位点dna片段的扩增
[0169]
根据对应的sgrna靶位点设计相应的引物见下表6。
[0170]
表6 pspd-sgrna靶位点检测引物序列
[0171][0172]
根据2
×
rapidtaqmastermixpcr酶的说明书配制表7反应体系，pcr扩增程序为：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃30s，36个循环；72℃5min；4℃。pcr产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，在蓝光切胶仪上把目的条带切下来，用胶回收试剂盒e.z.n.a
tm
gelextractionkit，将目的dna条带回收并保存于-20℃备用。
[0173]
表72
×
rapidtaqmastermixpcr酶反应体系
[0174][0175][0176]
(4)t7ei酶切分析pspd-sgrna-cas9的切割效率
[0177]
将上面回收的dna根据t7核酸内切酶i的说明书配制表8酶切反应体系及程序。
[0178]
表8t7e1酶切反应体系及反应程序
[0179][0180]
酶切产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，利用凝胶成像分析软件biocaptmw通过条带的灰度估算11条sgrna介导的切割效率。
[0181]
二、实验结果
[0182]
结果如图8所示，结果显示，sgrna2和sgrna11的打靶效率分别高达62.8％和63.1％。
[0183]
实施例3针对pspd安全位点的同源打靶载体ki-pspd-npsp-bexa的构建
[0184]
选择sgrna11位点进一步做验证，克隆其上游ra 350bp同源臂(核苷酸序列如seq idno:1所示)和下游la3511bp同源臂(核苷酸序列如seq id no:2所示)，构建大片段转基因同源打靶供体质粒ki-pspd-npsp-bexa。ki-pspd-npsp-bexa载体构建技术路线如图9所示。通过扩增携带15bp重组接头的三个片段inf-la、inf-ra和inf-neogfp，然后在 cep112-npsp-bexa(其为中国专利cn201711477805.5的超螺旋供体质粒 cep112-la340ra3219)，载体基础上，用noti和smai双酶切载体后把inf-la连上，得到 pspd-la-npsp-bexa载体，再将pspd-la-npsp-bexa载体用spei酶切，将inf-neogfp连上得到pspd-la-neogfp-npsp-bexa载体，最后将pspd-la-neogfp-npsp-bexa载体用xhoi 酶切，将inf-ra连上，最终得到了ki-pspd-npsp-bexa。
[0185]
一、整合位点左右臂的扩增
[0186]
1、实验方法
inf-pspd-ra为3541bp，电泳条带大小符合预期。
[0205]
三、筛选标志(neogfp)的扩增
[0206]
1、实验方法
[0207]
根据载体cep112-npsp-bexa质粒的序列信息设计筛选标志(neogfp)的pcr扩增引物，并以cep112-npsp-bexa载体为模板，使用2
×
rapid taq master mix酶扩增筛选标志，引物如表 11所示
[0208]
表11 neogfp扩增引物
[0209][0210]
之后，pcr产物凝胶电泳切胶纯化回收。
[0211]
2、实验结果
[0212]
琼脂糖凝胶进行电泳结果如图12所示，结果显示目的条带neogfp为2627bp，电泳结果符合预期。
[0213]
四、筛选标志同源臂(inf-neogfp)的扩增
[0214]
1、实验方法
[0215]
以切胶纯化回收的筛选标志(neogfp)为模板使用高保真酶prime star扩增带同源臂的筛选标志，pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化回收，于-20℃冰箱保存备用。其扩增引物如表12所示。
[0216]
表12 inf-neogfp扩增引物
[0217][0218]
2、实验结果
[0219]
琼脂糖凝胶进行电泳结果如图13所示，结果显示目的条带inf-neogfp为2638bp，符合预期，目的条带切胶纯化回收保存备用。
[0220]
五、cep112-npsp-bexa载体的双酶切
[0221]
1、实验方法
[0222]
使用fastdigest noti和fastdigest smai对cep112-npsp-bexa载体进行双酶切，在37℃恒温水浴锅中酶切1h，酶切体系见下表13。
[0223]
表13：
[0224][0225]
酶切后产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，将目的条带切胶纯化回收，并保存于-20℃冰箱备用。
[0226]
2、实验结果
[0227]
cep112-npsp-bexa载体fastdigestnoti和fastdigestsmai双酶切的琼脂糖凝胶进行电泳结果如图14所示，结果显示酶切后两段分别为25941bp和373bp，电泳结果符合预期，将目的条带25941bp切胶纯化回收。
[0228]
六、inf-la的连接到cep112-npsp-bexa载体
[0229]
1、实验方法
[0230]
根据无缝克隆试剂盒(hdcloningkit)说明书配制表14连接反应体系，吹打混匀后于50℃连接15min。
[0231]
表14：
[0232][0233]
吸取4μl连接产物到50μl冰上融化的transstbi3感受态细胞中，用移液枪轻柔吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴45s(热激)，再冰浴2min，加入500μllb液体培养基，放在37℃摇床中220rpm复苏1h，吸取200μl复苏后的菌液涂于含有氨苄青霉素的la固体培养板中，均匀铺满，置于37℃培养箱中过夜培养，待有明显的白色菌落长起来时，挑取单克隆菌接种于500μl相应抗性lb培养基中，摇床培养2h后，进行菌液pcr鉴定，菌液pcr鉴定引物见下表15。
[0234]
表15菌液pcr鉴定引物：
[0235][0236]
将鉴定的阳性结果送测，测序正确的菌液扩大培养，利用质粒抽提试剂盒e.z.n.a.
tm
plasmidminikitⅰ抽提制备得到的质粒pspd-la-npsp-bexa，保存于-20℃冰
箱备用。
[0237]
2、实验结果
[0238]
pspd-la-npsp-bexa菌液pcr鉴定的琼脂糖凝胶进行电泳结果如图15所示，结果显示菌液pcr鉴定的目的条带为1076bp，符合预期，挑选符合目的条带的菌液扩大培养。
[0239]
七、pspd-la-npsp-bexa质粒的酶切
[0240]
1、实验方法
[0241]
使用fastdigest spei对pspd-la-npsp-bexa质粒进行酶切，在37℃恒温水浴锅中酶切1h，酶切体系见下表16。酶切后产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，将目的条带切胶纯化回收，并保存于-20℃冰箱备用。
[0242]
表16酶切反应体系：
[0243][0244][0245]
2、实验结果
[0246]
pspd la-npsp-bexa质粒酶切后产物的琼脂糖凝胶进行电泳如图16所示，结果显示酶切后两段分别为25605bp和690bp，将目的条带25605bp切胶纯化回收备用。
[0247]
七、inf-neogfp连接pspd-la-npsp-bexa质粒
[0248]
1、实验方法
[0249]
根据无缝克隆试剂盒(hd cloning kit)说明书配制表17的连接反应体系，吹打混匀后于50℃连接15min。
[0250]
表17无缝克隆反应体系：
[0251][0252]
吸取4μl连接产物到50μl冰上融化的trans stbi3感受态细胞中，用移液枪轻柔吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴45s(热激)，再冰浴2min，加入500μl lb液体培养基，放在37℃摇床中220rpm复苏1h，吸取200μl复苏后的菌液涂于含有氨苄青霉素的la固体培养板中，均匀铺满，置于37℃培养箱中过夜培养，待有明显的白色菌落长起来时，挑取单克隆菌接种于500 μl相应抗性lb培养基中，摇床培养2h后，进行菌液pcr鉴定，菌液pcr鉴定引物见下表 18。
[0253]
表18菌液pcr鉴定引物：
[0254][0255]
将鉴定的阳性结果送测，测序正确的菌液扩大培养，利用质粒抽提试剂盒e.z.n.a.
tm
plasmidminikitⅰ抽提制备得到的质粒pspd-laneogfp-npsp-bexa。保存于-20℃冰箱备用。.
[0256]
2、实验结果
[0257]
菌液pcr鉴定的琼脂糖凝胶进行电泳如图17所示，结果显示菌液pcr鉴定的目的条带为1564bp，电泳结果符合预期。
[0258]
八、pspd-la-neogfp-npsp-bexa质粒的酶切
[0259]
1、实验方法
[0260]
将pspd-laneogfp-npsp-bexa质粒使用fastdigestxhoi酶切，在37℃恒温水浴锅中酶切1h，酶切体系见下表19。
[0261]
表19酶切反应体系
[0262][0263]
酶切后产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，将目的条带切胶纯化回收，并保存于-20℃冰箱备用。
[0264]
2、实验结果
[0265]
酶切产物琼脂糖凝胶进行电泳如图18所示，结果显示酶切后两段分别为23152bp和5103bp，电泳结果符合预期，将目的条带23152bp切胶纯化回收。
[0266]
九、inf-ra的连接入pspd-la-neogfp-npsp-bexa质粒
[0267]
1、实验方法
[0268]
根据无缝克隆试剂盒(hdcloningkit)说明书配制表20的连接反应体系，吹打混匀后于50℃连接15min。
[0269]
表20无缝克隆反应体系
[0270]
[0271]
吸取4μl连接产物到50μl冰上融化的trans stbi3感受态细胞中，用移液枪轻柔吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴45s(热激)，再冰浴2min，加入500μl lb液体培养基，放在37℃摇床中220rpm复苏1h，吸取200μl复苏后的菌液涂于含有氨苄青霉素的la固体培养板中，均匀铺满，置于37℃培养箱中过夜培养，待有明显的白色菌落长起来时，挑取单克隆菌接种于500 μl相应抗性lb培养基中，摇床培养2h后，进行菌液pcr鉴定，菌液pcr鉴定引物见下表 21。
[0272]
表21：
[0273][0274]
最后用去内毒质粒抽提试剂盒e.z.n.a.tm endo-free plasmid mini kitⅱ抽提制备得到的 ki-pspd-npsp-bexa质粒，于-20℃冰箱保存备用。
[0275]
2、实验结果
[0276]
菌液pcr鉴定的琼脂糖凝胶进行电泳如图19所示，结果显示菌液pcr鉴定的目的条带为 984bp，电泳结果符合预期，挑选符合目的条带的菌液扩大培养。
[0277]
十、ki-pspd-npsp-bexa载体的酶切鉴定
[0278]
1、实验方法
[0279]
pspd同源打靶载体ki-pspd-npsp-bexa构建完成，对其进行酶切鉴定。按照下表22和 238配制酶切反应体系，置于37℃恒温水浴锅中酶切30min，酶切产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
[0280]
表22 ki-pspd-npsp-bexa载体酶切反应体系：
[0281][0282]
表23 ki-pspd-npsp-bexa载体酶切反应体系：
[0283]
[0284][0285]
2、实验结果
[0286]
酶切结果如图20所示，结果显示构建成功的ki-pspd-npsp-bexa载体用fastdigest sgsi、 fastdigest snabi和fastdigest smai酶切时，目标片段的长度分别为：13007bp、8735bp、4103bp 及842bp。当用fastdigest kpn2i、fastdigest bshti、fastdigest smai酶切时，目标片段的长度分别为：10576bp、7644bp、6978bp及1499bp。
[0287]
选取酶切条带正确的菌液送测验证，当测序结果正确时，至此pspd同源打靶载体 ki-pspd-npsp-bexa构建成功，载体图如图21所示。
[0288]
实施例4定点整合bexa的转基因细胞的筛选
[0289]
一、实验方法
[0290]
1、实施例3制备得到的pspd-sgrna11-cas9表达质粒与同源打靶载体 ki-pspd-npsp-bexa共转染杜洛克胚胎成纤维细胞
[0291]
复苏杜洛克公猪胚胎成纤维细胞5f1，当细胞汇合到80％～90％时，弃去培养基，加2mldpbs清洗一次，用0.05％trysin-edta将细胞从培养皿上消化下来，吸取含有1
×
106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90g离心5min，弃去上层培养液，加1mlopti-mem
tm i reducedserum medium冲悬细胞，90g离心5min，弃去上层培养液，加100μl电转液，按照下表24配制共转染反应体系。
[0292]
表24共转染反应体系
[0293][0294]
使用电转仪nucleofector
tm 2b，转染程序为a-033。电转后的细胞按照梯度稀释到25ml，然后铺到20个10cm细胞培养皿上，每个皿加1ml电转后的细胞和9ml 15％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2培养箱培养，3天后更换培养基继续培养。
[0295]
2、定点整合bexa的转基因细胞的筛选
[0296]
待细胞长成比较好的单克隆细胞团时，先在明亮显微镜下找出克隆团，再切换到荧光下观察，如果有荧光且细胞状态良好，用马克笔画圈做好标记，相反则弃去。当有荧光的单克隆细胞团和没有荧光的单克隆细胞团比较接近时，要用枪头小心刮去没有荧光的细胞，保证荧光细胞的纯度。弃去上层培养基，加3ml dpbs清洗2遍，避免有漂浮的细胞在单克隆细胞团上。接着将克隆环用75％的酒精清洗2遍再用dpbs清洗2遍，稍微风干后把克隆环放于做好标记的单克隆细胞团上，加30μl 0.05％trysin-edta消化细胞，加入适量完全培养基，将细胞转移到48孔板中，在细胞培养箱内培养，24h后换液继续培养。待细胞长满后，
加100μl 0.05％ trysin-edta消化细胞，加400μl完全培养基终止，置于荧光显微镜下观察，荧光纯度较好的传到24孔板中培养，24h后换液继续培养。待细胞长满后，加200μl 0.05％trysin-edta消化细胞，加800μl完全培养基终止，置于荧光显微镜下观察，荧光纯度较好的传到12孔板中培养， 24h后换液继续培养。
[0297]
待细胞长满后，加200μl 0.05％trysin-edta消化细胞，加800μl完全培养基终止，置于荧光显微镜下观察，进行pspd位点单克隆细胞系荧光筛选，荧光纯度较好的，取出900μl细胞冻存两管备用。
[0298]
余下100μl细胞，加900μl完全培养基继续培养，长满后消化下细胞用dna抽提试剂盒 e.z.n.a.rtissue dna kit提取细胞基因组dna，对单克隆细胞系进行整合位点的pcr鉴定图，再对整合进基因组载体的完整性进行pcr鉴定，为确保整合片段的完整性，使用了8对引物以覆盖全部片段，后续用测序鉴定基因完整性，鉴定引物见下表25。
[0299]
表25定点整合bexa的转基因细胞鉴定引物序列：
[0300][0301][0302]
pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定条带正确后切胶回收，胶回收产物送测鉴定，以确保基因序列正确无误。
[0303]
二、实验结果
[0304]
pspd位点定点整合bexa的转基因的单克隆细胞系荧光筛选的结果如图22所示，
pspd位点定点整合bexa的转基因的单克隆细胞系的la和ra检测结果如图23所示，pspd位点定点整合bexa的转基因的单克隆细胞的测序结果如图24所示。
[0305]
结果显示，已经成功将23656bp的转基因片段高效整合入猪基因组，其中公猪细胞定点整合效率达33.3％，是测试的各位点定点整合效率均值的3.1倍，母猪细胞定点整合效率是均值的2.5倍。
[0306]
实施例5定点整合bexa的转基因细胞筛选标志删除和克隆猪构建
[0307]
一、定点整合bexa的转基因细胞筛选标志删除和克隆猪构建
[0308]
将实施例4鉴定成功的细胞复苏到24孔板上，长满后将荧光纯度高状态最好的细胞各取出100μl转入12孔板混匀，置于培养箱内培养，余下的细胞继续冻存。待细胞长满后加200μl0.05％trysin-edta消化细胞，加800μl完全培养基终止。取出600μl提取细胞基因组dna再次进行鉴定。余下400μl转移到新的孔再加600μl完全培养基，6h后待细胞贴壁时弃去上层培养液，加200μlcre重组酶删除两个loxp序列间的筛选标志neoegfp，一次可能没有完全删除，就在重复一到两次，最终得到marker-free转基因细胞。
[0309]
二、点整合转基因猪的制备
[0310]
1、实验方法
[0311]
利用删除标志后的细胞作为核移植供体细胞(核供体)，利用体细胞核转移(somaticcellnucleartransfer，scnt)技术制备转基因克隆猪。具体方法如下：
[0312]
(1)猪卵母细胞－颗粒细胞复合体(cocs)的采集及体外成熟培养
[0313]
从猪屠宰场(广东省天河肉联厂)收集猪卵巢，放入含有1％双抗(双抗为lifetechnology的产品：penicillin-streptomycin-glutamine)的28～37℃生理盐水中并于4h内送回实验室。用37℃的生理盐水清洗后拿带有18号针头的10ml注射器抽取直径为2～6mm卵泡中的卵母细胞。在显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹3层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体(cumulusoocytecomplexes，cocs)，用m199成熟培养液洗涤后，转入提前置于co2培养箱中孵育4h以上的加有500μlm199培养液的四孔板内，在39℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养42～44h。
[0314]
(2)成熟培养后cocs上颗粒细胞去除和成熟卵的挑选
[0315]
卵母细胞成熟后，将cocs转移到含透明质酸酶的离心管中用移液器吹打后将液体转移到30mm培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤后于实体显微镜下挑选排出第一极体的卵母细胞。
[0316]
(3)供核细胞的准备
[0317]
用胰酶消化后离心洗涤，用hn操作液(无钙h-ncsu-23显微操作液)将细胞沉淀重悬并吹打均匀后用作核供体。
[0318]
hn操作液的配方如表26(所有试剂均为分析纯级别，购自广州康龙生物科技有限公司)。
[0319]
表26：
[0320][0321]
(4)卵母细胞的去核与注核
[0322]
挑选已排出第一极体且形态良好的卵母细胞，用外径为100～120μm的固定针，内径为15～ 20μm的去核针采用盲吸法去核：在65mm无菌培养盘中加入约50μl的操作液滴，并用石蜡油覆盖，然后将30个左右的卵母细胞和适量的体细胞移入其中。用固定针固定住卵母细胞，用去核针拨动卵母细胞使极体在大约5点钟的位置。用去核针沿3点钟位置刺进去，去除极体及附近的胞质，之后把针撤出并将极体和胞质吐出，挑选一个体细胞注入卵周隙中即完成胚胎重构过程。重构胚胎放入胚胎培养液中恢复培养1h。
[0323]
(5)卵母细胞和体细胞的融合及激活
[0324]
将重构卵分批转移到融合液中平衡2min后用融合/激活液洗涤3遍，按每批5～8个放入已铺满融合液的融合槽内，用实心玻璃针拨动重构卵使供核细胞-受体卵的细胞膜接触面与电极平行，施加120v/mm,100μs,2dc的直流电脉冲诱导融合同时激活重构胚，接着用胚胎培养液洗涤 3遍后立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，置于39℃，5％co2饱和湿度的培养箱中，4h后在体视显微镜下判定融合情况。将已融合的重构胚用胚胎培养液洗涤5遍后，转入预平衡好的胚胎培养液，置于39℃，饱和湿度，低氧(5％o2+5％co2+90％n2)的条件下培养。
[0325]
(6)手术移植克隆胚生产转基因猪
[0326]
受体母猪为广东省华农温氏畜牧股份有限公司的优质母猪。本实施例采用输卵管移植法，胚胎发育处于为2细胞或4细胞期时进行移植。手术当天对母猪禁食，手术前保定母猪并对它进行全身静脉麻醉。手术部位选择在倒数第二对乳头中间部位，先用清水清洗手术部位及四周，擦干后先用碘酒大范围消毒，再用75％酒精脱碘。盖上手术布同时暴露手术部位，沿腹中线切开皮肤和皮下肌肉，然后分离皮下脂肪和腹膜，手探入腹腔，慢慢牵引出子宫和输卵管，检查排卵情况。将装有胚胎的吸胚管从输卵管伞口插入，小心将胚胎吹入。然后恢复子宫和输卵管到腹腔内。常规手术缝合，术后连续4天注射抗生素消炎。即能得到
定点整合外源dna的转基因猪。
[0327]
2、实验结果
[0328]
以删除标志后的单克隆细胞为核供体细胞制备体细胞克隆胚胎，随后移植到5头代孕母猪子宫输卵管内，其中有四头母猪妊娠，怀孕率达80％，产下20头活仔，转基因猪活仔达4头/ 窝(图25)，其中一头母猪产下8头活仔。
[0329]
转基因猪外观和发育均正常，该位点插入外源基因对动物安全性较高。
[0330]
实施例6pspd定点整合bexa的转基因猪的鉴定
[0331]
一、pspd定点整合bexa的转基因猪pcr鉴定
[0332]
1、实验方法
[0333]
取实施例5生产的转基因克隆猪耳皮组织抽提dna，利用pcr扩增启动子和目的基因。引物见表27。
[0334]
pcr扩增程序为：98℃5min；98℃10s，60℃10s，72℃30s，32个循环；72℃5min；4℃。
[0335]
表27定点整合转bexa转基因克隆猪pcr检测引物
[0336][0337]
2、实验结果
[0338]
结果如图26所示，结果显示所有仔猪均正确整合了目的基因完整片段，经测序，其核苷酸序列如seq id no：158所示。
[0339]
二、pspd定点整合bexa的转基因猪mrna水平检测
[0340]
1、实验方法
[0341]
选取实施例5生产的转基因克隆猪检测目的基因bexa mrna表达水平。
[0342]
选取13日龄和18日龄转基因小猪2头，安乐死后采取各组织样，心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、前腿肌、后腿肌、眼肌、皮肤、皮下脂肪、脑、腮腺、颌下腺、舌下腺。用组织rna抽提试剂盒tissue rnakit分别抽提上述标记组织样的rna，抽提过程避免rna降解。
[0343]
利用一步法反转录试剂盒ii one step rt-pcr kit(dye plus)将抽提的rna反转录成cdna。随后以反转录的cdna为模板进行rt-qpcr试验，根据试验结果检测和分析整合的外源基因rna水平的相对表达情况，定量引物见表28。
[0344]
表28定点整合bgegxyap的转基因克隆猪rt-qpcr检测引物
i线性化的px330质粒互补的粘性末端，合成对应的oligo。
[0364]
合成的sgrna oligo进行退火程序：95℃5min，10℃1min，2个循环；95℃5min， 10℃3min。
[0365]
退火产物与线性化的px330骨架参考t4 dna ligase说明书连接。连接产物加入trans 5α感受态细胞，轻轻混匀。随后冰浴20～30min，42℃热激45s，加入平衡至室温的lb培养基复壮30min。取200μl菌液涂板，过夜培养后挑取单克隆菌接种于500μl相应抗性lb培养基中，200rpm，37℃恒温摇床培养6h。
[0366]
使用hu6-f：gagggcctatttcccatgatt测序验证，测序正确的菌落20％甘油保存备用，完成h11-sgrna-cas9打靶载体构建。
[0367]
表29高效打靶位点sgrna合成
[0368][0369]
2、供体载体h11-npsp-bexa的构建
[0370]
供体载体h11-npsp-bexa构建技术路线如图32。
[0371]
1)h11位点la和ra臂的扩增
[0372]
根据ncbi上猪h11基因序列设计la和ra臂臂pcr扩增引物，以杜洛克猪胚胎成纤维细胞基因组dna为模板，使用2
×
rapid taq master mix酶分别扩增左同源臂h11-la，右同源臂h11-ra，pcr产物进行凝胶电泳后切胶回收。接着在h11-la的5’端添加h11-sgrna靶点，用于细胞内线性化环装载体，扩增引物见表30。
[0373]
表30左同源臂h11-la和右同源臂h11-ra扩增引物
[0374][0375]
2)la同源臂克隆并构建h11-la-npsp-bexa
[0376]
以h11-la为模板，使用高保真酶primestar先用引物la+sgrna-f和la+sgrna-r扩增，将h11sgrna靶点gttcctggaagtttagatca ggg加入h11-la 5端，获得 sgrna-h11-la，再以sgrna-h11-la为模板，用引物inf-h11-la-f和inf-h11-la-r扩增，获得携带重组接头的inf-h11-la(381bp)，备用；
[0377]
首先用fastdigest noti和fastdigest smai酶切载体cep112-npsp-bexa(其为中国专利 cn201711477805.5的超螺旋供体质粒cep112-la340ra3219)，去除原载体携带cep112位点 la，切胶纯化获得noti-cep112-npsp-bexa-smai；然后用inf-h11-la-f和inf-h11-la-r引物(表31)，以h11-la为模板，添加h11-la与noti-cep112-npsp-bexa-smai片段重组接头，获得inf-h11-la。
[0378]
表31 inf-h11-la扩增引物
[0379][0380]
接着使用无缝克隆酶(hd cloning kit)将h11-la克隆到 noti-cep112-npsp-bexa-smai载体上，获得h11-la-npsp-bexa。连接体系见表32。
[0381]
表32无缝克隆反应体系
[0382][0383]
连接产物加入trans 5α感受态细胞，轻轻混匀。随后冰浴20～30min，42℃热激45s，加入平衡至室温的lb培养基复壮30min。取200μl菌液涂板，过夜培养后挑取单克隆菌接种于 500μl相应抗性lb培养基中，200rpm，37℃恒温摇床培养6h。使用表33的引物测序验证，测序正确的菌落20％甘油保存备用。
[0384]
表33菌液pcr鉴定引物。
[0385][0386]
3)ra同源臂克隆并构建同源打靶载体h11-npsp-bexa
[0387]
因h11-la-npsp-bexa携带cep112-ra同源臂3’端只携带一个xhoi位点，无法将其完整切除，先在h11-la-npsp-bexa载体ra同源臂5’端标记基因内部引入一个xhoi位，再将其切除。
[0388]
步骤如下：先用spel切掉h11-la-npsp-bexa载体上spei-cmv-neogfp-spei筛选标记基因部分序列，再以cep112-npsp-bexa(其为中国专利cn201711477805.5的超螺旋供体质粒 cep112-la340ra3219)载体为模板，使用2
×
rapid taq master mix酶，以引物inf-neogfp-f： ttgattattgactagcttagggttaggcgttttgc；inf-neogfp-r： accacactggactagctcgagcgacagatccataac，在其末端添加xhoi酶切位点 (ctcgag)后扩增出完整cmv-neogfp-polya-loxp，用无缝连接技术重新链接到 h11-la-npsp-bexa载体中(spel酶切后的)，pcr
扩增程序为：98℃5min；98℃5s，60℃10s， 72℃30，35个循环；72℃5min；4℃。反应结束后将pcr产物进行凝胶电泳分离纯化回收，用于后续连接。得带有部分重叠标记基因的中间载体h11-laneogfp-npsp-bexa-cep112-ra，连接体系见表34。
[0389]
表34无缝克隆反应体系
[0390][0391]
接着使用fastdigest xhoi酶切h11-la-neogfp-npsp-bexa-cep112-ra，去除cep112-ra同源臂及残留的筛选标记基因，切胶纯化回收获得xhoi-h11-la-neogfp-npsp-bexa-xhoi。
[0392]
然后用inf-h11-ra-f和inf-h11-ra-r引物(表35)，以h11-ra为模板，添加h11-ra 与xhoi-h11-la-neogfp-npsp-bexa-xhoi，获得inf-h11-ra，并将其克隆到 xhoi-h11-la-neogfp-npsp-bexa-xhoi，获得h11位点同源打靶载体h11-npsp-bexa。
[0393]
表35 inf-h11-ra扩增引物
[0394][0395]
同源打靶载体h11-npsp-bexa加入trans 5α感受态细胞，轻轻混匀。随后冰浴20～30min，42℃热激45s，加入平衡至室温的lb培养基复壮30min。取200μl菌液涂板，过夜培养后挑取单克隆菌接种于500μl相应抗性lb培养基中，200rpm，37℃恒温摇床培养6h。使用表36的引物测序验证，测序正确的菌落20％甘油保存备用。
[0396]
表36菌液pcr鉴定引物
[0397][0398]
按照下表37配制酶切反应体系对其进行酶切鉴定。用fastdigest sgsi、fastdigest snabi和 fastdigest afei酶切时，预期目标片段的长度分别为：17340bp、4386bp、4102bp及842bp。选取酶切条带正确的菌液送到华大基因(广州)进行测序验证，当测序结果正确时，至h11同源打靶载体h11-npsp-bexa构建成功。
[0399]
表37 h11-npsp-bexa载体酶切反应体系
[0400][0401]
3、h11位点整合bexa的转基因细胞的筛选和鉴定
[0402]
1)h11位点整合bexa的转基因细胞的筛选
[0403]
复苏杜洛克公猪胚胎成纤维细胞，当细胞汇合到80％～90％时，弃去培养基，加2ml dpbs 清洗一次，用0.05％trysin-edta将细胞从培养皿上消化下来，吸取含有1
×
106个细胞的悬浮液至新的离心管中，90g离心5min，弃去上层培养液，加1mlopti-mem
tm i reduced serummedium冲悬细胞，90g离心5min，弃去上层培养液，加100ul电转液，按照下表6配制点转染反应体系。使用电转仪nμcleofectortm 2b，转染程序为a-033。
[0404]
按照表38所示的体系，将打靶质粒h11-sgrna-cas9与供体质粒h11-npsp-bexa共转染杜洛克胚胎成纤维细胞。电转后的细胞按照梯度稀释到25ml，然后铺到20个10cm细胞培养皿上，每个皿加1ml电转后的细胞和9ml 15％fbs的dmem培养基，在37℃、5％co2培养箱培养，7天后更换培养基继续培养。
[0405]
表38共转染反应体系
[0406][0407]
2)h11定点整合bexa的转基因细胞的鉴定
[0408]
与pspd定点整合bexa的转基因细胞的筛选方法一致。用0.25％胰酶消化掉转基因阳性细胞克隆团，用dna抽提试剂盒e.z.n.a.rtissue dna kit提取细胞基因组dna，对单克隆细胞系进行整合位点的pcr鉴定，再对整合进基因组载体的完整性进行pcr鉴定。pcr产物送到华大基因(广州)进行测序鉴定，以确保基因序列正确无误，鉴定引物见下表39。
[0409]
表39定点整合bexa的转基因细胞鉴定引物
[0410][0411]
二、实验结果
[0412]
结果如表40和41所示。实施例5的克隆转基因猪效率达2.15％(knock in(ki)转基因猪头数/移植胚胎总数)，是其他位点和技术获得克隆效率均值0.62％的3.5倍。
[0413]
表40不同位点定点整合效率比较
[0414]
[0415][0416]
注释：cep112和rosa26位点整合效率数据来源于本团队专利cn201711477805.5和已发表的文献(pmid:31818875)，pspd和h11位点整合效率为实施例5和本对例得到；ki效率，利用极限稀释法，转基因发生定点整合的细胞克隆团/挑选携带绿色荧光蛋白标记egfp荧光标记克隆团总数。
[0417]
表41不同位点转基因/编辑猪克隆效率比较：
[0418][0419]
备注：pdpd数据为实施例5获得，其他转基因位点数据来源于本团队历年积累数据，部分见已发表论文(pmid:31818875和pmid:29784082)。
[0420]
批次2为批次1扩繁的f1代转基因胚胎细胞系经cre酶处理，删除neogfp标记后，直接克隆。ki(knock in)：定点整合技术(转基因+编辑)；piggybac：piggybac转座子介导转基因技术，随机整合；
[0421]
克隆效率＝总仔/胚胎总数。
[0422]
实施例7利用pspd位点构建节粮环保猪育种群
[0423]
本发明转基因猪育种群构建方法适合转基因动物新品种培育，该方法与基因编辑动物育种方法不同，需要结合转基因定点整合技术和安全位点，将有效的转基因片段整合到猪相同基因组安全位点，构建6个以上无血缘关系系祖，组建转基因动物育种群。利用该技术，猪品种构建时间仅需2个世代即可获得一定规模的，由转基因动物纯合子组建的新育种群，相对传统新品种或品系数十年的育种周期，采用本发明的方法仅需2年即可完成，在转基因动物育种中具有重要经济价值。
[0424]
一、实验方法
[0425]
1、杜洛克猪系祖pef细胞获得方法
[0426]
以杜洛克猪温氏s21品系为基础，筛选6个三代以内无共同祖先的特级或1级公猪系祖，以保证血缘的广泛性。另从核心群一级母猪中选择6头三代以内无共同祖先的母猪系祖，作为以上公猪系祖的配种对象。对以上6头公猪和6头母猪进行一一选配，要求待配种的母猪与公猪之间3代内没有共同祖先。母猪怀孕25～35天龄时，取出胚胎，用dmem冲洗三次后，加入消化培养基(含工作浓度1mg/ml胶原酶ⅳ、5％fbs和1％青链霉素的dmem)消化2～4 小时至组织蓬松，加入1ml血清(含1％青链霉素双抗)铺板，第二天，加入含有12％(v/v) fbs和青链霉素双抗的高糖dmem(glutamax
tm
添加剂)培养液中维持培养2～3天，获得每对系祖的后代的雌性和雄性胚胎成纤维细胞(pef)，接着用表42中引物进行性别鉴定，后面做f0转基因猪，公母均通过克隆获得。
[0427]
利用2
×
taq master mix(vazyme公司)分别扩增不同杜洛克猪家系胚胎dna 中sry基因片段。pcr反应程序：95℃1min；95℃15s，60℃，15s；72℃,60s；35个循环；72℃2min， 4℃1h。反应体系参考vazyme 2
×
taq master mix说明书，反应结束后用1％琼脂糖电泳。 beta-actin-f和beta-actin-r为内参基因的扩增引物，sry-f和sry-r为y染色体特异性基因sry 扩增引物，sry扩增阳性为公猪，无条带为母猪。
[0428]
表42胚胎性别鉴定引物
[0429][0430]
2、节粮环保转bexa基因导入杜洛克猪群体的方法
[0431]
复苏上述6个杜洛克猪家系的雌性和雄性胚胎成纤维细胞(pef细胞)，然后按照实施例 4的方法，将4μg的实施例3制备的打靶载体pspd-sgrna11-cas9质粒dna与10μg实施例3制备的供体载体ki-pspd-npsp-bexa质粒dna预混后置于冰上，利用lonza电穿孔转染系统中a-033程序，将上述预混质粒dna转染到每个杜洛克猪家系的pef细胞中，然后采用极限稀释法，将转染后的细胞稀释到20～50个细胞/ml铺板，加入含有12％(v/v)胎牛血清的dmem完全培养基中，置于co
2 5％、38.5℃细胞培养箱中连续培养14天，每周更换一次完全培养
基，待表达egfp荧光蛋白的细胞克隆团刚好长满整个4倍目镜视野，取油性笔标记细胞克隆团位置后，无菌镊子夹取8
×
8mm的细胞克隆环小心的套取上述细胞克隆团，然后在克隆环中加入0.25％胰酶消化，然后将消化后的细胞用移液枪转移到48孔培养板中扩大培养，用表43中引物鉴定目标基因整合情况。
[0432]
表43定点整合pspd位点转bexa基因细胞鉴定引物序列：
[0433][0434]
其中，pspd-jdla-f和pspd-jdla-r为针对同源臂la的检测引物，pspd-jdra-f和 pspd-jdra-r为针对同源臂ra的检测引物，bg17-f和eg1314-r为针对目的基因bexa的检测引物。
[0435]
接着将每个杜洛克猪家系的转基因猪细胞(雌性和雄性)，按照实施案例4提到的cre处理方法删除neogfp细胞筛选标记，然后用于克隆胚胎构建。
[0436]
接着按照实施例5中克隆胚胎构建方法，分别构建每个杜洛克猪家系的雌性和雄性胚胎, 按1：1数量混合后，移植到4～6头代孕母猪输卵管内，生产6个杜洛克猪家系的转基因克隆公猪和母猪，用其组建f0代节粮环保型转基因猪育种群(杂合子+/-，即每个pspd等位基因位点只含1个转基因)，转基因基因型鉴定引物见表44进行转基因猪基因型鉴定。
[0437]
表44转基因基因型鉴定引物
[0438][0439]
以猪基因组dna为模板，使用表42中两对引物，利用2
×
taq master mix(vazyme公司) 分别扩增野生型猪pspd(若未整合转基因，目的条带为909bp，若发生转基因整合，则因插入片段太大，普通taq酶无扩增产物)和定点整合转bea基因猪的基因片段(ki-tg，转基因猪扩增产物1278bp，阴性猪无扩增)。
[0440]
pcr反应程序：95℃1min；95℃15s，60℃，15s；72℃，60～90s；35个循环；72℃ 2min，4℃1h。反应体系参考vazyme 2
×
taq master mix说明书，反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳，检测。
[0441]
如pspd-f1/f2和pspd-f2/npsp-r2两对引物均扩出目的条带，则为转基因杂合子；若 pspd-f1/f2阳性条带,pspd-f2/npsp-r2阴性条带，则为野生型猪；若pspd-f1/f2阴性条带,pspd-f2/npsp-r2阳性条带，则为纯合子。
[0442]
然后将每个家系的f0代转基因克隆公猪和母猪，分别与其他家系的转基因公猪或母猪交配，扩繁f1代节粮环保转基因猪，见图37，根据孟德尔遗传定律，f1代克隆猪中转基因猪纯合子(+/+)、转基因猪杂合子(+/-)和野生型(-/-)，理论比例1：2：1，选择其中转基因猪纯合子(+/+)公猪和母猪，组建节粮环保猪育种核心群，然后按照群体继代选育方法选育和扩群。由于杜洛克猪在猪杂交繁育体系中，为终端父本，因此仅需扩繁1万头转基因纯合子公猪即可满足150万头母猪配种需要，满足一个大型农牧集团3000万头肉猪出栏规模，按每头猪节约饲料25kg计算，饲料成本4元/kg，可节约饲料成本30亿元。
[0443]
二、实验结果
[0444]
1、6个家系杜洛克猪胚胎成纤维细胞系建系结果
[0445]
从温氏s21系杜洛克猪核心群中，筛选6个三代以内无共同祖先特级或1级公猪系祖，另从核心群一级母猪中选择6头三代以内无共同祖先母猪系祖，避开三代内有血缘关系的公猪和母猪，进行一一选配，怀孕25～35天取胎建系，其胚胎性别鉴定结果见图33。
[0446]
2、6个杜洛克家系转基因细胞筛选结果
[0447]
将打靶载体pspd-sgrna11-cas9质粒dna与供体载体pspd-npsp-bexa质粒dna转染上述分离pef细胞，获得6个家系(图34中的d1到d6)的转基因细胞系。
[0448]
3、节粮环保转基因猪育种群构建
[0449]
将上述转基因细胞系构建克隆胚胎，获得6个家系的转基因克隆猪，然后按照图35交配方法，扩繁f1代转基因猪，每个家系扩繁80头f1后代，其中转基因猪纯合子20头，转基因杂合子40头(图36～37)。选取其中发育良好的，健康的转基因纯合子组建核心群，然后按照群体继代选育方法，繁育扩大群体规模，完成节粮环保猪育种群组建。
[0450]
4、转基因猪基因型鉴定结果
[0451]
使用表42中转基因基因型鉴定引物进行转基因猪基因型鉴定，野生型wt猪由于无外源基因定点插入，扩增结果仅有单一的电泳带909bp，转基因杂合子由于含有wt和ki-tg两种基因型，因此扩增后出现909bp和1278bp条带，而转基因纯合子只含有ki-tg基因型，扩增只出现单一的1278bp，根据如图36扩增结果，f1代纯合子刚好6头/24头，占比1/4，符合孟德尔遗传规律。
[0452]
最后所应当说明的是，由于，目前发现的每个安全位点都是很容易推广应用其他动物和细胞，例如：h11(pmid:21092859、pmid:21464299、pmid:24304893、pmid:26381350、pmid: 30591434、pmid:34862376和pmid:31344144)和rosa26位点(pmid:18037879、doi: 10.1007/978-1-60761-811-9_10、pmid:22564063、pmid:29991797、pmid:28596588和pmid: 27063570)。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。除了猪外，在其他实施方式中，还可以尝试用于人、猴子、牛、羊、兔、鼠，鸡、鸭等其他动物及其细胞，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。