一种月桂二酸生物发酵调控的新方法与流程

1.本发明涉及月桂二酸发酵领域，具体为一种月桂二酸生物发酵调控的新方法。


背景技术：

2.月桂二酸是有十二个碳原子的长链二元酸，又称为十二烷酸，是一种饱和脂肪酸。月桂二酸是长链二元酸体系中最重要的产品，属于新兴产业之一，是国家生物基材料重点支持的领域，广泛应用于高档尼龙基材、热融胶、香料、塑料和高档润滑油等精细化工领域，市场需求量较大。
3.目前生产月桂二酸主要有生物发酵法和化学合成法，其中化学合成法，收率低、成本高，生产条件苛刻，生产过程复杂，环境污染严重。而生物发酵法在常温、常压下即可生产，其生产成本仅为化学合成方法生产成本的三分之二，生产环境良好，但现有的生物发酵技术存在发酵周期长、产酸率低的问题，致使生产成本高。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，提供一种月桂二酸生物发酵调控的新方法。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种月桂二酸生物发酵调控的新方法，包括如下步骤，
6.步骤一，发酵培养基配料包括磷酸二氢钾，硝酸钾，尿素，酵母膏，玉米浆，玉米浆干粉，葡萄糖，氯化钠，消泡剂；
7.步骤二，接种，接种后对初始参数进行设定；
8.步骤三，溶氧控制：接种后初始通气比为0.6vvm-0.9vvm,此后调整空气流量与搅拌转速，保证溶氧率；
9.步骤四，诱导：底糖耗完，溶氧开始明显上升后加入0.1％-0.8％烷烃进行诱导，待溶氧持续下降20min诱导完成；
10.步骤五，二次补糖：诱导完成后开始补入36-51％浓度的无菌葡萄糖，初始补糖速度，按照2h周期取样检测od和残糖，根据检测残糖1-5g/l控制补糖速度，od
600
达到50-70后停止补糖；
11.步骤六，调ph：等od
600
达到50-70后开始调节ph，ph调整至 6.8-8.0，最好6.8-7.1自控；
12.步骤七，补烷烃：当od达到50-70停止补糖一次补入4m3正构十二烷烃进行生物转化，此后每2h取样离心后测量明油层厚度控制到0.5mm-3mm补加烷烃；
13.步骤八，补料：进入发酵产酸阶段后适当补加碳源和氮源维持菌体活性；
14.步骤九，持续发酵至170小时，产酸达250g/l,转化率为94％。
15.通过采用上述技术方案，可以在相同时间内或更短发酵时间内，提高月桂二酸转化率，增加产量产量，以降低生产成本。
16.进一步的，步骤一中所述的发酵培养基配料成分及含量为磷酸二氢钾5g/l-7g/l，硝酸钾6g/l-14g/l，尿素3g/l-8g/l，酵母膏 3g/l-8g/l，玉米浆10g/l-20g/l，玉米浆干粉0.5g/l-1.5g/l，葡萄糖40g/l-70g/l，氯化钠1g/l-3g/l，消泡剂0.45g/l-1g/l。
17.进一步的，步骤二中所述的接种量15％-20％，接种后初始参数设定为：温度29.5-31℃、罐压0.04-0.08mpa，ph4.5-5.0自控。
18.进一步的，步骤三中所述的溶氧率不低于30％。
19.进一步的，步骤七中检测频次为每4h/次，取样测产酸和ph(以 ph计为准)。
20.进一步的，步骤八中所述的碳源有葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、乙酸、草酸等其中一种或者多种；氮源有硝酸、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵等铵盐其中一种或多种。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.1、本发明通过在发酵过程中增加诱导及控制合适的ph，使细胞充分合成相关酶系(诱导合成相关的酶系主要是细胞色素p450(cyp) 和nadph细胞色素p450还原酶(cpr)等)，在发酵产酸过程中使月桂二酸结晶析出，维持发酵液的流动性和渗透压，给菌体提供适宜的生存环境让菌体正常代谢，保证发酵后期持续产酸，可以在相同时间内或更短发酵时间内，提高月桂二酸转化率，增加产量产量，以降低生产成本。
附图说明
23.图1为本发明发酵转化阶段产酸数据曲线
具体实施方式
24.下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
25.实施例一：一种月桂二酸生物发酵调控的新方法，包括如下步骤，
26.步骤一，发酵培养基配料包括磷酸二氢钾5g/l，硝酸钾6g/l，尿素3g/l，酵母膏3g/l，玉米浆10g/l，玉米浆干粉0.5g/l，葡萄糖40g/l，氯化钠1g/l，消泡剂0.45g/l；
27.步骤二，接种量15％，接种后初始参数设定为：温度29.5℃、罐压0.04mpa，ph4.5自控；
28.步骤三，溶氧控制：接种后初始通气比为0.6vvm,此后调整空气流量与搅拌转速，保证溶氧不低于30％；
29.步骤四，诱导：底糖耗完，溶氧开始明显上升后加入0.1％％烷烃进行诱导，待溶氧持续下降20min诱导完成；
30.步骤五，二次补糖：诱导完成后开始补入36％浓度的无菌葡萄糖，初始补糖速度，按照2h周期取样检测od和残糖，根据检测残糖1g/l 控制补糖速度，od
600
达到50后停止补糖；
31.步骤六，调ph：等od
600
达到50后开始调节ph，ph调整至6.8，最好6.8自控；
32.步骤七，补烷烃：当od达到50停止补糖一次补入4m3正构十二烷烃进行生物转化，此后每2h取样离心后测量明油层厚度控制到 0.5mm补加烷烃。每4h/次取样测产酸和ph(以ph计为准)；
33.步骤八，补料：进入发酵产酸阶段后适当补加碳源和氮源维持菌体活性，可选择的
碳源有葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、乙酸、草酸等其中一种或者多种；氮源有硝酸、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵等铵盐其中一种或多种；
34.步骤九，持续发酵至170小时，产酸达250g/l,转化率为94％。
35.实施例二：一种月桂二酸生物发酵调控的新方法，包括如下步骤，
36.步骤一，发酵培养基配料包括磷酸二氢钾6g/l，硝酸钾10g/l，尿素5g/l，酵母膏3g/l-8g/l，玉米浆15g/l，玉米浆干粉1g/l，葡萄糖55g/l，氯化钠2/l，消泡剂0.7g/l；
37.步骤二，接种量17.5％，接种后初始参数设定为：温度30℃、罐压0.06mpa，ph4.8自控；
38.步骤三，溶氧控制：接种后初始通气比为0.75vvm,此后调整空气流量与搅拌转速，保证溶氧不低于30％；
39.步骤四，诱导：底糖耗完，溶氧开始明显上升后加入0.5％烷烃进行诱导，待溶氧持续下降20min诱导完成；
40.步骤五，二次补糖：诱导完成后开始补入45％浓度的无菌葡萄糖，初始补糖速度，按照2h周期取样检测od和残糖，根据检测残糖3g/l 控制补糖速度，od
600
达到60后停止补糖；
41.步骤六，调ph：等od
600
达到60后开始调节ph，ph调整至7.3，最好6.9自控；
42.步骤七，补烷烃：当od达到60停止补糖一次补入4m3正构十二烷烃进行生物转化，此后每2h取样离心后测量明油层厚度控制到2mm 补加烷烃。每4h/次取样测产酸和ph(以ph计为准)；
43.步骤八，补料：进入发酵产酸阶段后适当补加碳源和氮源维持菌体活性，可选择的碳源有葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、乙酸、草酸等其中一种或者多种；氮源有硝酸、尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵等铵盐其中一种或多种；
44.步骤九，持续发酵至170小时，产酸达250g/l,转化率为94％。
45.实施例三：一种月桂二酸生物发酵调控的新方法，包括如下步骤，
46.步骤一，发酵培养基配料包括磷酸二氢钾7g/l，硝酸钾14g/l，尿素8g/l，酵母膏8g/l，玉米浆20g/l，玉米浆干粉1.5g/l，葡萄糖70g/l，氯化钠3g/l，消泡剂1g/l；
47.步骤二，接种量20％，接种后初始参数设定为：温度31℃、罐压 0.08mpa，5.0自控；
48.步骤三，溶氧控制：接种后初始通气比为0.9vvm,此后调整空气流量与搅拌转速，保证溶氧不低于30％；
49.步骤四，诱导：底糖耗完，溶氧开始明显上升后加入0.8％烷烃进行诱导，待溶氧持续下降20min诱导完成；
50.步骤五，二次补糖：诱导完成后开始补入51％浓度的无菌葡萄糖，初始补糖速度，按照2h周期取样检测od和残糖，根据检测残糖5g/l 控制补糖速度，od
600
达到0后停止补糖；
51.步骤六，调ph：等od
600
达到70后开始调节ph，ph调整至8.0，最好7.1自控；
52.步骤七，补烷烃：当od达到70停止补糖一次补入4m3正构十二烷烃进行生物转化，此后每2h取样离心后测量明油层厚度控制到3mm 补加烷烃。每4h/次取样测产酸和ph(以ph计为准)；
53.步骤八，补料：进入发酵产酸阶段后适当补加碳源和氮源维持菌体活性，可选择的碳源有葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、甘油、乙酸、草酸等其中一种或者多种；氮源有硝酸、尿素、磷
酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵等铵盐其中一种或多种；
54.步骤九，持续发酵至170小时，产酸达250g/l,转化率为94％。
55.实验结果及分析
56.生物转化阶段产酸数据及曲线如图1、表1-1。
57.表1-1实验组与对比组转化阶段产酸数据表
[0058][0059]
图1发酵转化阶段产酸数据曲线
[0060]
数据分析：由数据曲线可以看出实验组与对比组在发酵前期周期 26h-98h，产酸140g/l左右时实验组与对比组产酸速度基本一致，在 98h-146h阶段实验组产酸速度基本稳定，发酵液颜色变白明显有大量月桂二酸析出，而且发酵液流动性良好；对比组在98h以后产酸速度大幅下降，146h基本停止产酸，发酵液流动性逐渐处于半固体状态，流动性很差；实验二1#、2#重复试验结果与实验方案一实验组结果保持一致。
[0061]
实验结论
[0062]
本次实验结果与实验预期基本符合，实验组发酵全期产酸速率保持稳定，而且实验组发酵过程具有可重复性，重复1#、2#发酵周期177h，产酸分别为250.52g/l、254.17g/l；对比组发酵98h,产酸 140g/l后产酸速率大幅下降出现拐点。保证发酵后期持续产酸能力的因素是使月桂二酸结晶析出，维持发酵液的流动性和渗透压，给菌体提供适宜的生存环境让菌体正常代谢。
[0063]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。