一株花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌SW-1及其应用的制作方法

incanum)、美洲亚隔孢壳菌(didymella americana)和禾谷镰刀菌(f.graminearum)中的一种或多种。
9.本发明还进一步提供了一种微生物菌剂，其含有所述花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1或其发酵物或其代谢产物。
10.优选的，所述微生物菌剂为花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的发酵液。
11.优选的，所述发酵液中花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的活菌数为3
×
10
10
～4
×
10
10
个/ml。
12.本发明进一步提供了一种生物有机肥，包括所述微生物菌剂0.5～1份、畜禽粪便固态发酵物80～85份、腐植酸11～17份、崩解剂0.5～1份、膨润土3～5份。
13.所述生物有机肥制备方法，将所述微生物菌剂、畜禽粪便固态发酵物、腐植酸、崩解剂、膨润土，混合造粒。
14.本发明还进一步提供了一种微生物-有机-无机相结合的制剂—生物菌土壤改良剂，包括所述生物有机基肥25～55份、硝酸磷肥15～25份、硫包衣尿素15～25份、硫酸钾15～25份；
15.所述微生物-有机-无机相结合的制剂—生物菌土壤改良剂的制备方法，将所述生物有机肥、硝酸磷肥、硫包衣尿素、硫酸钾，掺混。
16.本发明还提供一种了所述花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1、所述微生物菌剂、生物有机肥或所述土壤改良剂在防治花生果斑病中的应用。
17.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
18.1、本发明的花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1对新孢镰刀菌(f.neocosmosporiellum)可可毛色二孢菌(lasiodiplodia theobromae)、茄病镰刀菌(fusarium solani)、细极链格孢(alternaria tenuissima)、木贼镰刀菌(f.equiseti)、炭疽菌(colletotrichum incanum)、美洲亚隔孢壳菌(didymella americana)和禾谷镰刀菌(f.graminearum)等病原真菌均具有明显的抑制作用，抑菌谱广，抑菌效果强，具有较好的生物防治作用，该菌株对生态环境无害，不易引起病原的抗药性。与国内外其它贝莱斯芽孢杆菌菌株相比，该菌具有繁殖速度快、环境适应性强、营养要求简单，抗病谱广，是一种安全、高效、广谱防治植物真菌病害的新型生防微生物。
19.2、本发明利用一株对花生果斑病病原菌(新孢镰刀菌)具有明显抑制效果的花生根际微生物—生防贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)sw-1制备一种微生物-有机-无机相结合的制剂—生物菌土壤改良修复剂，通过有机物促进有益微生物定殖，无机肥料改善土壤微生物群落结构，增强植物抗逆性，能够有效降低花生果斑病发病率。
20.3、本发明提供的生物菌土壤改良修复剂，具有制备简单，成本低，易于工业化生产，防治效果良好，且不会造成环境污染，有益于农业生产长期、健康、可持续发展，具有良好的开发应用前景。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图获得其他的附图。
22.图1为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1菌落形态，其中a为培养12h，b为培养48h；
23.图2为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1显微形态，其中a为培养12h，b为培养48h；
24.图3为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的16s rdna基因的凝胶电泳结果；其中m为dm2000；1为sw-1-1；2为sw-1-2；3为sw-1-3；4为ck-产物；
25.图4为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1系统发育树；
26.图5为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1与近源物种间的ani热图分析；
27.图6为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1与近源物种间的aai热图分析；
28.图7为实施例，即花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1对不同植物病原菌的拮抗效果，其中每组图片中的左侧图片为空白对照组，右侧图片为接种供试菌sw-1的实验组。
29.生物保藏说明
30.贝莱斯芽孢杆菌sw-1，拉丁文名为bacillus velezensis；
31.该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年12月30日，保藏编号为cgmcc no.24219。
具体实施方式
32.本发明提供一株花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1，株已于保藏日期2021年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为cgmcc no.24219。
33.本发明还提供了所述的花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1在防治植物病原真菌中的应用，所述植物病原真菌为新孢镰刀菌(f.neocosmosporiellum)、可可毛色二孢菌(lasiodiplodia theobromae)、茄病镰刀菌(fusarium solani)、细极链格孢(alternaria tenuissima)、木贼镰刀菌(f.equiseti)、炭疽菌(colletotrichum incanum)、美洲亚隔孢壳菌(didymella americana)和禾谷镰刀菌(f.graminearum)中的一种或多种。
34.本发明还进一步提供了一种微生物菌剂，其含有所述花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1或其发酵物或其代谢产物。
35.在本发明中，所述微生物菌剂为花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的发酵液。
36.在本发明中，所述发酵液中花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的活菌数为3
×
10
10
～4
×
10
10
个/ml；优选为3.1
×
10
10
～3.8
×
10
10
个/ml；进一步优选为3.15
×
10
10
～3.6
×
10
10
个/ml；更优选为3.19
×
10
10
个/ml。
37.本发明进一步提供了一种生物有机肥，包括所述微生物菌剂0.5～1份、畜禽粪便固态发酵物80～85份、腐植酸11～17份、崩解剂0.5～1份、膨润土3～5份；优选包括所述微生物菌剂0.75份、畜禽粪便固态发酵物82.5份、腐植酸14份、崩解剂0.75份、膨润土4份。
38.在本发明中，所述生物有机肥制备方法，将所述微生物菌剂畜禽粪便固态发酵物、腐植酸、崩解剂、膨润土，混合造粒。
39.本发明还进一步提供了一种微生物-有机-无机相结合的制剂—生物菌土壤改良剂，包括所述生物有机基肥25～55份、硝酸磷肥15～25份、硫包衣尿素15～25份、硫酸钾15～25份；优选包括所述生物有机基肥40份、硝酸磷肥20份、硫包衣尿素20份、硫酸钾20份。
40.在本发明中，所述微生物-有机-无机相结合的制剂—生物菌土壤改良剂的制备方法，将所述生物有机肥、硝酸磷肥、硫包衣尿素、硫酸钾，掺混。
41.本发明还提供一种了所述花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1、所述微生物菌剂、生物有机肥或所述土壤改良剂在防治花生果斑病中的应用。
42.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.实施例1花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的分离筛选及鉴定
44.1菌株分离纯化
45.自河北省秦皇岛市昌黎县白坨村(119.06
°
e,39.46
°
n)花生种植区采集健康花生根际土壤样品，取10g土壤样品置于250ml锥形瓶中，加入90ml无菌水，并放入三颗玻璃珠，220rpm于摇床中摇动15min，静置30sec，制备得到10-1
土壤稀释液；用移液器从10-1
土壤稀释液中吸出1ml，加入盛有9ml无菌水的大试管中，充分混匀制备得到10-2
土壤稀释液；再从10-2
土壤稀释液中吸出1ml，加入盛有9毫升无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液，以此类推，分别制备得到10-4
，10-5
，10-6
土壤稀释液，随后分别吸取100μl稀释度为10-4
、10-5
、10-6
的土壤稀释液涂布于含有花生果腐病病原菌(新孢镰刀菌fusarium neocosmosporiellum)的固体pda平板上，置于28℃培养箱培养3d，挑取抑制病原菌生长的菌落采用平板划线法进行分离纯化培养，编号，保存为甘油液并放入-20℃冰箱备用。
46.2菌株形态特征的观察
47.鉴定方法：于固体pda平板上用接种环划线接种纯种的菌株，30℃培养24h，观察菌落形态呈表面凸起光滑的圆形凝胶状，48h后菌落边缘呈不规则状，贴合培养基，易挑起(见图1)。菌体革兰氏染色结果表明生防菌sw-1为革兰氏阳性菌，产芽孢(见图2)。
48.3生理生化特性的测定
49.利用bcl生化鉴定卡对46项碳源利用、抑制和耐药性以及酶类活性的生化试验生理生化特性进行了测定，结果如表1所示，鉴定结果为芽孢杆菌属(bacillus sp.)，与贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)模式种匹配度不是最高。
50.表1生防芽孢杆菌sw-1生理生化结果
[0051][0052]
注：“+”与
“‑”
分别表示阳性和阴性反应，*代表不稳定的结果，生理生化测试的缩写是指bcl卡说明。
[0053]
4分子生物学鉴定
[0054]
用煮沸法提取生防芽孢杆菌sw-1基因组dna，以提取的基因组为模板扩增16sr dna序列，选用细菌通用引物16sf(如seq id no.2所示)5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’和16sr(seq id no.3所示)5
’‑
tacggttaccttgttacgactt-3’进行pcr扩增。pcr反应体系：模板dna 1μl，16sf 1μl，16sr 1μl，mix 12.5μl，ddh2o 9.5μl。pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min；用1％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增所得的产物，得到约为1.5kb的条带，同时阴性对照未出现扩增条带，表明体系未被污染(见图3)，将pcr产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，具体序列如seq id no.1所示。
[0055]
序列结果用软件dnaman 6.0拼接，于genbank中进行blast比对分析。结果显示，生防芽孢菌sw-1与贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis(基因登录号：mt626060&mt525304&mt605169&ok067365)的序列相似度最高；并且应用mega 6.0软件中的邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树(见图4)，由图可知，blast结果显示生防菌株sw-1与bacillus velezensis(基因登录号：mt626060&mt525304&mt605169&ok067365)的遗传距离最近，但与现有菌株存在明显的遗传差异。根据同源性比对和系统发育树结果分析，该专利菌株属于厚壁菌门，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，贝莱斯芽孢杆菌菌株。该菌株于2021年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24219。
[0056]
将花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1的菌体沉淀送至上海美吉生物医药科技有限公司利用illumina hiseq测序技术完成基因组扫描测序。于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#！/overview/bacillus％20velezensis中选取花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1近缘物种基因组序列(见表2)利用软件pyani(默认参数)和comparem v0.0.23(默认参数)进行平均核苷酸同源性(ani)和平均氨基酸同源性(aai)分析。花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1与近缘物种间ani值见表3和图5，花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1与3株近缘物种的ani值分别为97.80％、98.33％和99.99％，均大于95％的分类阈值。花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1与近缘物种间aai值见表4和图6，花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1与3株近缘物种的aai值在98.58％值99.98％，均大于95％的分类阈值，表明花生根际生防菌sw-1与3株近缘物种为同
一物种，即贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。
[0057]
表2近缘物种信息
[0058][0059]
表3花生根际生防贝莱斯芽孢杆菌sw-1与近缘物种间ani值(％)
[0060][0061]
表4花生根际生防贝莱斯芽孢杆菌sw-1与近缘物种间aai值(％)
[0062][0063]
尽管其生理生化特征与贝莱斯芽孢杆菌模式菌种有一定差异，但综合菌株的形态和分子生物学分析，鉴定花生根际生防菌株sw-1为一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)新菌种。
[0064]
实施例2生防菌株贝莱斯芽孢杆菌sw-1的应用
[0065]
1、花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1对植物病原菌的拮抗作用
[0066]
将新孢镰刀菌(f.neocosmosporiellum)、可可毛色二孢菌(lasiodiplodia theobromae)、茄病镰刀菌(fusarium solani)、细极链格孢(alternaria tenuissima)、木贼镰刀菌(f.equiseti)、炭疽菌(colletotrichum incanum)、美洲亚隔孢壳菌(didymella americana)和禾谷镰刀菌(f.graminearum)活化备用。
[0067]
挑取sw-1菌株甘油菌划线于lb固体培养基上，30℃培养48h，即得活化菌；利用平板对峙法对菌株进行拮抗能力的测定，以8种植物病原真菌为指示菌，接种于pda平板中央，周围接种供试菌sw-1，空白对照不接种供试菌株，每组试验重复3次，28℃培养，待空白对照中指示菌菌丝长满平板后，测量抑菌圈直径，花生根际生防贝莱斯芽孢杆菌sw-1与8种植物病原真菌的拮抗效果如图7所示，其抑菌圈结果如表5所示。
[0068]
表5花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1对病原菌拮抗效果
[0069][0070]
由图7和表5可知，结果显示花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1对9种植物病原真菌：新孢镰刀菌(f.neocosmosporiellum)、可可毛色二孢菌(lasiodiplodia theobromae)、茄病镰刀菌(fusarium solani)、细极链格孢(alternaria tenuissima)、木贼镰刀菌(f.equiseti)、炭疽菌(colletotrichum incanum)、美洲亚隔孢壳菌(didymella americana)和禾谷镰刀菌(f.graminearum)均具有显著地抑制作用。
[0071]
2、花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1微生物菌肥对花生果斑病的防治作用
[0072]
(1)种子液的制备
[0073]
挑取花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1甘油菌划线于lb固体培养基上，30℃培养48h，即得活化菌；将酵母浸粉2.50g、胰蛋白胨5.00g和氯化钠8.00g加入到水中搅拌使其溶解，用水定容至1l，即得种子液培养基；将所述活化菌转接于种子液培养基中，于30℃、200rpm/min培养12小时，得第一培养物，作为种子液使用。
[0074]
(2)液态发酵及花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1微生物菌剂的制备
[0075]
具体过程：将第一培养物作为液态摇瓶发酵的种子液，按5％体积的接菌量转接至装有液态发酵培养基(配方如下：酵母浸粉2.5％，玉米粉1.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸铵2.5％，ph＝7)的三角瓶中，于30℃、200rpm/min培养72h后得第二培养物。将所述第二培养物涂布平板进行计数，加入无菌玻璃珠200rpm/min充分震荡30min，85℃水浴15min以杀死营养体，随后梯度稀释并选取浓度为10-5
、10-6
、10-7
的菌悬液进行平板涂布，每个处理重复3次，37℃倒置培养14h后选择每个平板中的菌落数在30至300之间的进行平板计数，平板菌落计数结果为3.19
±
0.06
×
10
10
个/ml。
[0076]
将上述第二培养物，离心收集菌泥，并将菌泥与硅藻土按1:100的比例，混匀晾干备用，得到花生根际生防菌—贝莱斯芽孢杆菌sw-1微生物菌剂。
[0077]
(3)生物菌土壤改良修复剂的制备
[0078]
按照质量份数sw-1微生物菌粉0.75份、畜禽粪便固态发酵物82.5份、腐植酸14份、崩解剂0.75份和膨润土4份造粒，制备成颗粒型生物有机肥。
[0079]
按照包括所述生物有机基肥40份、硝酸磷肥20份、硫包衣尿素20份、硫酸钾20份。进行掺混，制备成一种微生物-有机-无机相结合的制剂—生物菌土壤改良剂，备用。
[0080]
(4)盆栽施用方法及防病试验
[0081]
2021年于河北科技师范学院昌黎校区研发中心进行生物菌土壤改良剂防治效果的盆栽试验。每盆装灭菌土3.5kg，分别以施用量为10g/盆(生物菌改良剂s1)和15g/盆(生物菌改良剂s3)为试验组，普通有机肥为空白对照。花生品种为冀花16号。
[0082]
盆栽试验结果见表6，结果表明石膏含量为10g/盆生物菌土壤改良剂对花生果斑病的防治效果为67.36％，增产率为26.84％；15g/盆生物菌土壤改良剂对花生果斑病的防治效果为41.15％。这表明生物菌土壤改良剂不仅对花生果斑病的防治效果显著，还有增产作用，但其施用量过多会导致防治效果降低。
[0083]
表6 2021年防病效果
[0084][0085]
(5)田间防治花生果斑病实例
[0086]
分别于2020年和2021年进行生物菌土壤改良剂及其配套方法的防病试验。
[0087]
2020年试验地点为河北省唐山市丰南区仁义试验田。土壤类型为沙壤土，播种前肥力水平见表7，前茬未种植作物。选用花生品种为白沙308，包括空白对照在内的所有处理的花生种子均利用悬浮种衣剂(2.5％精甲霜灵+3.75％的咯菌腈)进行拌种，阴干后备用。以100kg/亩生物菌土壤改良修复剂(生物菌改良剂s1)为试验组，空白对照施加普通有机肥。
[0088]
表7 2020年河北省唐山市丰南区仁义试验田土壤肥力水平
[0089][0090]
2021年试验地点为河北省唐山市丰南区仁义试验田。土壤类型为沙土，前茬为小麦，播种前肥力水平见表8。选用花生品种为白沙308，包括空白对照在内的所有处理的花生种子均利用悬浮种衣剂(0.3％吡虫咯苯甲)进行拌种，阴干后备用。分别以施用量为100kg/亩、125kg/亩和150kg/亩生物菌土壤改良修复剂为试验组(生物菌改良剂s1，s2和s3)，施用量为150kg/亩，空白对照为普通有机肥。
[0091]
表8 2021年河北省唐山市丰南区仁义试验田土壤肥力水平
[0092][0093]
在播种前沙土或者沙壤土相对含水量65-70％(含水量15-20％)时将各个处理的肥料撒施于土壤表面，25-30厘米深翻。每个处理3次重复，于收获前10d利用五点取样法对
花生果腐病病害进行分级调查并测定产量和对花生果腐病的防治效果。荚果分级标准：(0级：无病斑症状；1级：1-8个直径1mm左右斑点或1-2个直径2mm以上的斑点；2级：9-16个直径1mm左右斑点或3-4个直径2mm以上的斑点；3级：17-24个直径1mm左右斑点或5-6个直径2mm以上的斑点；4级：》24个直径1mm左右斑点或》6个直径2mm以上的斑点)。病情指数、防治效率、干果亩产量和增产率分别用公式(1)、(2)和(3)表示。
[0094]
公式(1)：
[0095]
病情指数＝∑(病果数
×
该病果级值)/(总果数
×
最高级值)
×
100。
[0096]
公式(2)：
[0097]
防治效率(％)＝(空白对照区病情指数－处理区病情指数)/空白对照区病情指
×
100。
[0098]
公式(3)：
[0099]
增产率(％)＝(处理区亩产产量－空白对照区亩产量)/空白对照区亩产量
×
100。
[0100]
如下表9和表10所示为计算得出的2020年和2021年生物菌土壤改良剂对田间防治花生果斑病的病情指数、防治效率、增产率以及干果亩产量结果。
[0101]
表9 2020年sw-1菌剂对田间防治花生果斑病的防病结果
[0102][0103]
*不同的小写字母代表组间的差异显著(p《0.05)。
[0104]
表10 2021年sw-1菌剂对田间防治花生果斑病的防病结果
[0105][0106]
*不同的小写字母代表组间的差异显著(p《0.05)。
[0107]
2020年生物菌改良剂对田间防治花生果斑病的防病结果表明(见表9)：施用量100kg/亩生物菌土壤改良修复剂对花生果斑病的防治效果显著，防治效果为69.03％，增产率为17.59％。
[0108]
2021年生物菌改良剂对田间防治花生果斑病的防病结果表明(见表10)：施用生物菌土壤改良修复剂对花生果斑病的防治效果显著，防治效果在73.77％以上，增产率为20.66％-30.66％。
[0109]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。