hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562抑制成骨分化

1.本发明属于再生医学技术领域，具体涉及hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562抑制成骨分化，有望用于抑制异位骨再生。


背景技术：

2.异位骨化(ho)是指在正常骨骼系统之外形成的异常骨组织，异位骨化常继发于创伤之后，例如肢体骨折、关节置换术、脊髓损伤、脑损伤及烧伤，易发于髋、肘和膝关节周围，目前临床上预防和治疗创伤性异位骨化尚无有效的手段，前期主要用非甾体类抗炎药和放射疗法来预防，后期以手术切除为主，但这些方法存在疗效差、成本高、复发率高及延迟骨愈合等并发症。
3.人间充质干细胞具有向骨，软骨，脂肪，肌肉，肌腱等组织分化的潜力，许多临床前和临床研究显示人间充质干细胞是干细胞组织工程中产生新骨的重要种子细胞。骨髓来源间充质干细胞成骨向分化是一个复杂的过程，多种转录因子，信号通路及表观遗传调控因素均在这一过程中发挥着重要的作用，并参与精确控制细胞命运的过程。环状rna(circular rna，circrna)是一种由反向剪切产生的一大类环状闭合的单链rna，最早是在1993年首次被鉴定出来，到2013年才第一次对自然表达的circrna进行功能研究。越来越多的研究表明，circrna在细胞衰老、增殖和分化方面有着重要的生物学作用。hsa_circ_0001439和hsa_circ_0070562是两个在人骨髓来源msc表达的circrna分子，但其对人间充质干细胞成骨分化及骨形成的作用尚不清楚。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明经研究发现，敲减hsa_circ_0001493或者敲减hsa_circ_0070562可抑制间充质干细胞成骨向分化，有望应用于克服异位成骨的问题，为以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用提供了新的思路。
5.为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
6.本发明提供了抑制hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的试剂在制备抑制间充质干细胞成骨分化的药物中的应用。
7.本发明还提供了抑制hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的试剂在制备抑制异位骨再生的药物中的应用。
8.本发明经研究发现，hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的敲减可以抑制成骨分化，一方面为circrna在抑制间充质干细胞成骨向分化过程中提供了应用依据，为有针对性的运用小分子化合物抑制靶蛋白活性，在克服异位成骨的治疗方面提供了全新的理论和实验依据；另一方面也为hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562在以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用方面提供了新的思路。
9.优选地，所述间充质干细胞为人骨髓来源间充质干细胞。
10.优选地，所述抑制为抑制hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的表达。
11.优选地，所述试剂为sirna。
12.进一步地，所述sirna为seq id no.1、seq id no.2所示的核苷酸序列和/或seq id no.3、seq id no.4所示的核苷酸序列。
13.本发明还提供了一种非治疗目的的间充质干细胞成骨向分化的抑制方法，即通过降低hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的表达来达到抑制间充质干细胞成骨向分化的目的。
14.优选地，降低hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的表达采用基因沉默或基因敲除的方式实现。即通过向间充质干细胞转染沉默或敲除hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的sirna双链核酸的方式来抑制间充质干细胞成骨向分化。
15.本发明还提供了一种用于抑制间充质干细胞成骨分化的药物，所述药物包括抑制hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的试剂。
16.本发明还提供了一种用于抑制异位骨再生的药物，所述药物包括抑制hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562的试剂。
17.优选地，两种所述药物还包括药物学上可接受的载体。
18.进一步地，所述载体是药物领域中可接受的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(plga)、透明质酸等。
19.优选地，两种所述药物的剂型为临床上可接受的常规剂型。
20.进一步地，本发明对上述药物的剂型没有特殊的限制，可以制成本领域技术人员熟知的注射剂、片剂、胶囊剂、栓剂和粉针剂等。所制备的制剂可以是经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.本发明经研究发现了两个与调控成骨向分化密切相关的基因，即hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562。并且发现敲减hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562可抑制间充质干细胞的成骨向分化，从而揭示了hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562对间充质干细胞成骨向分化的调控作用，说明hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562可以用于抑制间充质干细胞成骨向分化，从而克服异位成骨；一方面为研发小分子化学工具调控干细胞成骨定向分化提供了全新的作用靶点，另一方面为以干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用奠定了坚实的基础。
附图说明
23.图1为qpcr产物鸟枪法测序测到hsa_circ_0070562和hsa_circ_0001493的环化位点；
24.图2为人骨髓间充质干细胞在成骨培养0天，3天，7天hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的表达量；
25.图3为敲减hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响(a的敲减效率显示成功敲低hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562但不影响其各自亲本基因表达，图中的左侧序列表示hsa_circ_0001493的外显子exon14的末尾核苷
酸序列(非划线部分)，外显子exon8的起始核苷酸序列(划线部分)，虚线表示设计的si的对应序列；图中右侧的序列表示hsa_circ_0070562的外显子exon3的末尾核苷酸序列(非划线部分)，外显子exon3的起始核苷酸序列(划线部分)，虚线表示设计的si的对应序列；b为msc敲减hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562后成骨诱导7天，alp下降，c为msc敲减hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562后成骨诱导14天，茜素红染色下降)。
具体实施方式
26.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
27.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
28.实施例1hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的鉴定和测序
29.1、细胞培养
30.人骨髓间充质干细胞来源于健康志愿者，已获得中山大学附属第八医院伦理委员会的审核批准。所用增殖培养基为低糖dmem(购自gibco)添加10％胎牛血清(购自四季青公司)。将培养至p3代的msc(具体培养方法见文献：peng w,li y,huang l.effects and safety of allogenic mesenchymal stem cell intravenous infusion in active ankylosing spondylitis patients who failed nsaids:a 20-week clinical trial.[j].cell transplantation,2014,23(10):1293-303.)接种于培养皿中，利用增殖培养基在37℃、5％co2下进行培养，每3天半换液1次，直至于倒置显微镜下观察细胞生长至80％汇合状态时，使用0.25％胰蛋白酶消化传代，传代后的p3-p5代msc用于后续的相关实验。
[0031]
2、对培养的msc进行rna提取，逆转录为cdna，设计跨hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562环化位点的qpcr引物(hsa_circ_0001493：forward primer(5
’‑3’
):tgccagcaaattttggcaga，reverse primer(5
’‑3’
):acatggtaccaaccgcacaa；hsa_circ_0070562：forward primer(5
’‑3’
):ttattggatacacctgtcaagactc，reverse primer(5
’‑3’
):ctgttccatcaggcttgctt)，之后进行qpcr(rna提取，circrna引物设计，qpcr相关方法参考已发表文献：wang,s.,z.wang,h.su,f.chen,m.ma,w.yu,and g.ye,et al.2021.“effects of long-term culture on the biological characteristics and rna profiles of human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells.”mol ther nucleic acids 26:557-574.)。
[0032]
3、送测序：
[0033]
将上述qpcr产物，连同引物一起送至艾基生物科技有限公司进行鸟枪法测序。测序结果显示(图1)，在msc中测到hsa_circ_0001493和hsa_circ_00705623的特有环化位点，表明两个circrnas在msc中确实存在。
[0034]
实施例2人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的表达量变化
[0035]
p3代msc人骨髓间充质干细胞接种至六孔板中，37℃、5％co2条件下培养，加入成骨分化培养基(增殖培养基，含0.2mm维生素c、10mmβ-磷酸甘油钠和100nm地塞米松)，分别
在第0天，3天，7天收集rna，qpcr检测hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的表达变化(relative rna expression)。
[0036]
结果显示(图2)，人骨髓间充质干细胞在成骨培养0天，3天，7天，hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的表达量上升。
[0037]
实施例3敲减hsa_circ_0001493和hsa_circ_0070562抑制人骨髓间充质干细胞成骨向分化
[0038]
1、sirna序列设计：
[0039]
通过设计特异性匹配circrna环化位点的sirna(小干扰rna)沉默基因的表达来观察抑制hsa_circ_0001493和/或hsa_circ_0070562表达对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响，si_circ_0001493和/或si_circ_0070562及对照sirna购于广州艾基公司，其中，sirna的序列如下：
[0040]
si_circ_0001493：
[0041][0042]
si_circ_0070562：
[0043][0044]
negative control(对照sirna)：
[0045][0046]
2、sirna应用于msc
[0047]
转染前24h将p3-p4代msc接种于十二孔板中，在人骨髓间充质干细胞生长至70％-80％汇合状态时，弃去培养基(实施例1的增殖培养基)，加入无血清培养基，使用lipofectamine rnaimax(购自英潍捷基)转染sirna，过夜培养后，更换成骨向分化培养基，每2天进行一次半换液。根据需要中间可加转染一次；7天和14天分别进行碱性磷酸酶alp和茜素红染色，观察第7天的alp活性，即alp activity on day7(u/g pro/15min)和第14天的ars染色定量，即ars staining quantification on day 14(od at 562nm)(si转染方法、alp染色和茜素红染色方法见发表文献：li,j.,p.wang,z.xie,s.wang,s.cen,m.li,and w.liu,et al.2019.“traf4 positively regulates the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells by acting as an e3 ubiquitin ligase to degrade smurf2.”cell death&differentiation 26(12):2652-2666.)。
[0048]
3、结果显示(图3)，si_circ_0001493组和si_circ_0070562组与对照组相比，其alp染色和ars染色明显降低，显示其成骨能力较对照组明显降低。
[0049]
综合实施例1-3可见，hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562在间充质干细胞成骨向分化过程中表达量逐渐升高；hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的敲减可抑制间充质干细胞成骨向分化。可见，hsa_circ_0001493、hsa_circ_0070562的沉默能够抑制间充质干细胞的成骨向分化能力，为促进间充质干细胞小分子靶点的应用和以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用提供了新的思路。
[0050]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。