一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法

1.本发明涉及一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法，属于纳米孔单分子探测技术领域。


背景技术：

2.基于固态纳米孔器件的dna单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，是目前研究和应用探索的热点。从2009年，clarke.j等人发现解旋酶修饰的mspa生物孔可以实现dna的测序(nature nanotech.4,265
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270,2009)，到2021年牛津纳米孔公司上市，生物纳米孔已经基本实现了dna的测序。但还有一些问题没有解决：解旋酶工作在未知原因状态下失效导致错误率，生物孔大小不易调节导致的待测物尺寸限制；在一些相对极端的环境中不易保存；与现代半导体工艺不兼容导致的成本高等。但对于固态纳米孔来说，可以控制孔的大小；孔也可以承受范围更广的温度，酸碱度，易保存；与半导体工艺兼容，可以量产这些优势，继续推动固态纳米孔测序技术的前进是非常有前景且具有重大意义的。
3.通过在溶液中电泳驱动分子穿过一个纳米尺度的孔可以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时，高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链dna分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本dna测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，dna穿孔速度过快，超出了通用仪器的时间分辨率，从而无法实现对单碱基的差别进行识别。如何利用固态纳米孔对dna分子进行捕获，对于研究溶液中对单分子的捕获，操纵，控制，并且研究其化学转化、分子内部动态变化等生物学过程具有非常重要的实际意义。
4.目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使dna分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应dna的生物学信息。但是单纯使用电场调节，dna的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，其时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使dna分子的穿孔时间延长，有效减慢dna在孔中的运动速度。减慢dna的穿孔速度，才有可能实现对不同碱基的分辨。
5.另一方面，现有的第二代高通量测序技术的基本原理是将待测物种的全基因组随机打碎成数百bp的小片段，然后经过体外扩增和修饰标定之后，利用一种“边合成边测序”的方法读取每一个小片段的序列，最后将全部小片段的序列通过一定的算法整合在一起，还原出全基因组的序列。需要指出的是，每个数百bp的小片段相对于人类的全基因组(约3
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109bp)来说实在太小，因此在小片段的比对和拼接环节的计算量和算法复杂度是极高
的，而且由于人类基因组中存在大量的重复序列，导致现有算法得出的全基因组仍然有5％～10％的不确定度；因此对于精确度要求很高的医疗诊断、药物筛选以及高端科研领域，需要对整个序列进行十几甚至上百次的重复测序，无疑大大增加了测序的成本且降低了时间效率。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种基于纳米孔器件利用介电泳技术对dna实现实时可控捕捉的方法，可实现对单分子(如：dna、肽链等)的实时可控捕捉、减速穿孔的方法，极大地提升探测时间分辨率。
7.本发明涉及的介电泳，是电介质在非均匀电场中受力的现象。所有物体都是电介质，这种非均匀电场可以诱导出有限大小的物体的偶极矩，从而在非均匀电场中受力。这一力的存在不需要物体本身带电，力的大小同时取决于物质的介电性质，形状，大小以及场强的变化频率。介电泳在分离不同大小，分子量的生物分子中已有许多应用，并且这种力不会使生物分子变性。在纳米孔器件中如果引入合适的介电泳力，与电场力平衡，即可以大幅降低dna分子的穿孔速度，提高探测时间分辨率，此外还可以实现对于单分子的捕获和操控。
8.本发明提供的基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法，包括如下步骤：
9.s1、制作固态纳米孔薄膜；所述固态纳米孔薄膜包括依次复合的绝缘层ⅰ、导电层和绝缘层ⅱ；
10.s2、制作纳米孔测序装置；将所述固态纳米孔薄膜作为分隔电解池的正极和负极的隔膜，得到所述纳米孔测序装置；
11.s3、采用所述纳米孔测序装置进行检测；将待测的单分子加入至所述电解池的负极接地腔室中；测试时，在所述隔膜的两端施加直流电压，通过所述导电层引入交流电压，分别对所述单分子提供电场力和介电泳力，分别作为所述单分子穿过所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的驱动外场和停留在所述纳米孔内的捕捉力；通过控制所述介电泳力大于或近似等于所述电场力，实现对所述单分子的减速或捕获；
12.其中，所述电场力可以使单分子从孔一端电泳通过纳米孔，作为dna穿孔的驱动外场；所述介电泳力可以使dna分子被捕捉在固态纳米孔内；
13.通过检测正负极外电路的离子电流可以判断单分子如dna分子是否被捕捉在纳米孔内。
14.上述的方法中，所述固态纳米孔薄膜中，所述绝缘层ⅰ为氮化硅薄膜，厚度为20～50nm；所述导电层为钛金薄膜，厚度为5～10nm；所述绝缘层ⅱ为三氧化铝薄膜，厚度为1～20nm。
15.上述的方法中，所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径为5～30nm，孔深为50～80nm。
16.上述的方法中，测试时，所述电解池中盛放有电解液，所述电解液为nacl溶液、kcl溶液或licl溶液；
17.所述电解液的浓度为0.1～3.2mol/l，ph值为7～10。
18.上述的方法中，所述直流电压为0～1v；
19.所述交流电压的峰值为0～1v，频率为0.5～2mhz；
20.经过有限次试验可确定使dna穿孔速度降低所施加的最佳电压和频率。
21.基于上述方法，还可以解决dna测序中时间分辨率过低的问题，即提供了一种对dna进行测序的方法。采用本发明的方法对dna进行检测，确定了使dna穿孔速度降低所施加的最佳电压和频率后，适当加大直流电压从而控制dna穿孔的速度，从而解决dna在固态孔测序中时间分辨率过低的问题。
22.本发明突破传统的基于固态纳米孔器件的dna测序的方法，引入介电泳作为捕获dna的外场，同时可以调整电场力和介电泳力的相对大小来控制dna的穿孔速度，在不降低测量信号信噪比的前提下，使用直径10nm左右的sin固态纳米孔，有效降低dna分子穿过纳米孔器件的速度。显著提高了现有工作的时间分辨率，既可以保持高的电流信号信噪比，又可以避免引入由于使用很小的纳米孔(直径小于5nm)带来的dna分子与纳米孔壁不可控的相互作用问题，并且实验简单易行，重复性和可控性都比现有技术有显著提高。
23.相比于现有对基于固态纳米孔对dna分子探测的报道，本发明集中的优势体现在：
24.1、现有技术在dna分子穿孔探测的时间分辨率上距离单碱基的分辨依然遥遥无期，而本发明可以直接捕获dna，大大提高了现有报道的时间分辨率。而时间分辨率低的问题正是困扰固态纳米孔dna测序最大的障碍之一。常规的很多办法无法实现这一目的。
25.2、该三层纳米孔结构的制作过程与现代硅基芯片的生产工艺完全兼容且简单快速，可以实现大批量的量产，可以大大降低测序成本。
26.3、方法简单，易于操作。这种方法可重复性好，非常利于推广，不需要复杂的电路设计和程序设计，不需要引入复杂的体系和制作工艺，对技术要求不高，实验成功率很高，大大提高了实验效率。测量过程只需要加入待测物，然后施加特定的直流电压与交流电压，即可对待测物进行测量。理论上可以用于任意分子的捕获与检测。这大大提高了固态纳米孔对待测物的探测范围，扩展了其应用范围，例如单分子体外诊断等领域。
27.4、拓展了固态纳米孔的待测物范围。对于一些带电量小，甚至不带电的多肽、蛋白质等单分子，利用常规的直流电压驱动其过孔是很难实现的，但利用介电泳不需要物体本身带电的特性，可以利用介电泳力来驱动这些单分子的进入纳米孔内，从而实现探测，极大得拓展了固态纳米孔的待测物范围。
附图说明
28.图1为本发明所用固态纳米孔的光刻掩模板的图形的局部图，其整体为5英寸，掩模版的图案为周期性排布，图中列出了图案的详细数据；单个图案为3mm
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3mm，对应单个固态纳米孔芯片的大小为3mm
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3mm；每个3mm
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3mm图形中心有一个直径为443μm的圆形透光区域；为保证后期在4英寸硅片上分离每个3mm
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3mm的小基片，保证分离划片时走刀的准确，又使得硅片不会破损成随机小片，在每个小基片图案边界加了一些透光槽：透光条的宽度为282μm，长度为2000μm
29.图2为纳米孔器件(3mm
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3mm芯片)制作流程示意图；依次为双面旋涂光刻胶；a面用图1所示掩模版曝光，显影，去胶；利用反应离子束刻蚀去除a面的氮化硅；利用boe溶液刻蚀掉a面的二氧化硅；用丙酮清洗掉双面光刻胶；利用氢氧化钾溶液各向异性刻蚀硅，并暴露出b面的二氧化硅和氮化硅；b面旋涂光刻胶保护氮化硅；boe溶液刻蚀b面的二氧化硅；丙
酮清洗掉b面光刻胶；利用高压电子束蒸镀金属钛；利用原子层沉积技术镀三氧化二铝；投射电子显微镜打孔。
30.图3为特制的用于介电泳技术与固态纳米孔结合芯片的电泳池实物图；电泳池有两部分，需要将芯片放置在两者中间，并将电泳池结合在一起才能正常使用，图3(a)为两电泳池俯视图；俯视图下方两个圆形池槽是加入离子溶液的池槽，图3(b)为两泳池的正视图；正视图中上方两个突起，是施加直流电压并测量离子电流通过的电极；右方电泳池中间有四个细电极柱是用于连接到芯片导电层并施加交流电压(介电泳力)的电极，中间是用于防止离子溶液漏液的橡胶o圈；左方电泳池中间是纳米孔芯片的b面。
31.图4(a)实验原理示意图，上方为加入待测物(dna)的cis腔室，下方为正常离子溶液的trans腔室，两腔室只通过三层固态纳米孔连接；上下两方与直流电极连接，并施加v
dc
的直流电压，并记录离子电流；导电层(钛金)与交流电极连接，并施加交流电，产生介电泳，捕捉待测物；图4(b)施加交流电的装置实物图，函数发生器。
32.图5(a)为正常dna穿孔时的离子电流信号示意图；图5(b)蓝色实线为，加入样品后介电泳开启时，dna被捕捉在孔内的信号示意图；红色虚线为，未加入样品时，介电泳开启时，离子电流的信号示意图；介电泳的开启会使得孔内的离子快速重新分配，从而增大两腔室间测到的离子电流信号；红色虚线与蓝色实线之间的差值代表了，dna在孔内引起的离子电流下降；图5(c)实际测试时遇到的离子电流信号，只要介电泳(dep)开启，dna就会一直被捕捉在纳米孔内。
具体实施方式
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
34.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.一、制备芯片器件
36.制备可以放入透射电子显微镜中进行操作的固态纳米孔器件，从而实现利用透射电子显微镜中高能会聚电子束对器件悬空薄膜进行打孔操作，从而实现纳米孔器件。这其中包括了一系列传统半导体加工工艺中涉及的微纳加工工艺，并且还涉及了一系列现代前沿的纳米尺度加工技术。
37.具体方法如下：
38.1、首先，将(100)面4英寸300μm硅片，两面分别先后生长2μm的氧化硅，用低压化学气相沉积方法沉积50nm的低应力氮化硅。
39.2、然后制作光刻掩模版(图1)，目的是要在4英寸的硅片上做成很多3mm
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3mm的小基片周期分布，每个3mm
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3mm小基片图形中心有一个直径为443μm的圆形透光区域。为保证后期在4英寸硅片上分离每个3mm
×
3mm的小基片，保证分离划片时走刀的准确，又使得硅片不会破损成随机小片，在每个小基片图案边界加了一些透光的短划线：透光条的宽度为282μm，长度为2000μm。
40.3、然后利用光刻和反应离子束刻蚀将硅片一面(a面)的氮化硅按照光刻掩模版的图形刻透，露出氧化硅表面。另一面(b面)用光刻胶保护好。将保护好的4英寸硅片浸润在10：1的boe溶液中40分钟，除掉a面的氧化硅，暴露出300μm的硅，再使用koh各向异性腐蚀，(40％koh，80℃，6小时)腐蚀硅，腐蚀沿着(111)面进行。腐蚀穿的标准是：小窗格透光后再
过腐蚀一段时间。光学显微镜下氧化硅面很平整，没有岛状结构。这样就实现了一面只有二氧化硅和氮化硅的小窗格(20μm)悬空膜，下面有硅衬底作支撑。一般来讲，一张4英寸的硅片，可以解离得到800片3mm
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3mm小基片。
41.以上操作制作的芯片是常规的氮化硅固态纳米孔操作步骤，还需要制作导电层和第二个绝缘层，使用高压电子束蒸镀(仪器型号)的方法，的速度，蒸镀上2nm的钛和5nm的金，以此速率蒸镀上的导电层有良好的导电性且足够平整。制作绝缘层，可以使用原子层沉积技术(仪器型号)，利用三甲基铝(tma)与水的反应
42.al(ch3)3+3h2o＝al(oh)3+3ch4[0043][0044]
制作三氧化二铝绝缘层。因为三甲基铝在空气中会自燃，所以采用高纯的n2作为生长环境。同时需要将整个系统加热到需要的温度，放置样品后抽真空。n2在系统中不断地被充入和抽出，带走样品腔中的杂质和反应剩余的前驱体，保持样品腔中的洁净。在沉积过程中，先充入前驱体水，吸附一层后抽走残余的水。再充入前驱体三甲基铝，与水反应，得到一层目标产物三氧化二铝，再抽走残余的三甲基铝。不断循环，根据温度、材料、气体流速、目标厚度的不同，计算得到所需的循环数。目前采用的参数是在150℃的温度下，控制前驱气体气压在1～3atm，完成187个循环得到20nm致密的三氧化二铝绝缘层(图2)。
[0045]
二、透射电子显微镜进行纳米孔制作
[0046]
3mm
×
3mm芯片器件加工好之后，放入透射电子显微镜(fei tecnai f30)进行打孔操作，放大倍数调整到890k，束斑大小为：1，电子束聚到最小或稍大，5分钟左右，即可得到直径10nm左右、深度为80nm左右的三层结构纳米孔。打孔前后，样品杆要放在等离子体清洗仪中(o2：ar＝1:3，v/v)里清洗一分钟，去除有机污染。纳米孔器件制作好后，储存在真空干燥箱里备用。
[0047]
三、利用三层固态纳米孔捕捉dna
[0048]
由于这种三层固态纳米孔，需要将导电层接到交流电源上，但又不能与两个腔室里的电解液接触。本发明通过一系列浸润过程用丁晴o型圈将芯片封装入上述的电泳池中，泳池由cis腔和trans腔构成，两个腔之间只通过纳米孔进行连接，无其他连接通道(图3)。然后向两个腔中注入浓度为1摩尔每升的氯化钠溶液。溶液中含有1mm的edta和10mm的tris(ph＝7.4)。使用两个ag/agcl电极分别插入cis腔和trans腔中(用于产生直流电压与记录离子电流)，同时将信号发生器的负极与cis端的电极连接并接地，正极与和导电层接触的探针连接(图4)。
[0049]
然后向cis腔加入适量dna溶液，在cis腔和trans腔间施加100mv的直流电压，此时我们可以观察到正常dna穿孔信号(图5(a))。利用信号发生器在导电层与cis端施加频率为1mhz，峰峰值为500mv的方波交流电压，此时可以观察到，离子电流相对于基线电流(图5(b)，红色虚线)，有一个明显的下降，并稳定在下降后的电流值(图5(b)，蓝色实线)；当关闭信号发生器的产生的交流电压(介电泳)后，离子电流又能恢复到基线(图5(b))。离子电流的大小与介电泳施加与否密切相关，可以说明当介电泳力存在时，dna被捕捉在纳米孔内，离子电流产生下降，并稳定在当前的数值，即实现了对单分子的捕获；当介电泳力不存在时，dna被直流电压驱动穿孔，产生穿孔信号，离子电流会回到基线。这样的实验现象，证明
实现了对单分子(dna)的捕获。这样现象出现的前提是，作用在待测物上的直流电压提供的电场力(f
dc
)小于交流电提供的介电泳力(f
dep
)，从而会产生捕捉的实验现象，这其实是电场力与介电泳力竞争主导待测物的运动。所以当作用在待测物上的f
dc
＞f
dep
时，会观察到穿孔的实验现象；作用在待测物上的f
dc
≈f
dep
时，会观察到待测物减速穿孔，从而提高了探测的时间分辨率。
[0050]
四、利用三层固态纳米孔减速dna的穿孔并实现测序
[0051]
与第四步捕捉dna进行相同的操作，连接仪器，加入样品。固定直流电压为500mv，交流电频率1mhz，在1mv～1v范围内改变交流电峰峰值的大小，并从大到小改变。由于每个孔的理化性质，大小，形状，不完全相同，可以找到一个适当的峰峰值观察到，离子电流回到基线，即dna发生穿孔。此时电场力与介电泳力大小相当，dna在孔内受到的合力接近于0，此时穿孔速度很慢，可以用低频滤波器去处理得到的穿孔时的离子电流(目前商用纳米孔测序仪实现测序的主要原因，穿孔足够慢，可以用低频滤波器去探测信号)，从而读取dna的碱基信息，实现测序。