一种从头合成络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产络缌的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。


背景技术：

2.络缌((2e)-3-苯基-2-丙烯-1-基β-d-吡喃葡萄糖苷，rosin)又名松香，是l-苯丙氨酸的衍生物，也是最简单的肉桂醇糖苷，络缌可通过糖基化进一步修饰形成络塞维(rosavin)或洛塞琳(rosarin)，这三种化合物一并被称为红景天提取物。络缌具有神经系统保护、抗缺氧、抗抑郁及抗细胞凋亡等多种药理学活性。红景天提取物络缌，主要从景天科红景天属植物大株红景天的干燥根及根茎或干燥全草中提取获得，由于其具有较强的活性，因此吸引了越来越多的注意，随着市场需求的日益壮大，野生红景天被人为大规模采挖，数量急剧下降，从而限制红景天种群本身的维持和发展，另一方面其数量和格局的变化，又严重影响其高寒草甸生态系统，使其稳定性严重下降。随着人们对红景天提取物药理学作用认识的不断深入，需求将继续扩大，如果没有可持续替代的方法合成络缌等提取物，必将导致红景天属植物生物资源的大规模减少和生态系统的进一步破坏。基于此，1999年，hiroyuki akita等人以β-葡萄糖苷酶(ec 3.2.1.21)为催化剂在磷酸盐缓冲液(ph＝5)中利用肉桂醇和4-硝基苯基β-d-吡喃葡萄糖苷偶联得到rosin，但该方法使用疏水醇(肉桂醇)进行酶促糖苷化，使用了大量的醇作为溶剂，且产率较低，仅为11％。2019年，iman mirmazloum等人通过向红景天愈伤组织喂养不同前体物质生产rosin，发现当加入2mm反式肉桂酸培养24h可生产92mg/100g dw rosin，当加入2mm肉桂醛时产量为270mg/100g dw，加入2mm肉桂醇为240mg/100g dw，但远远不能满足工业化生产的需求。
3.合成生物学的快速发展促使越来越研究人员将生产植物天然产物的目光瞄向了微生物法生产。大肠杆菌(escherichia coli)是常用的细胞生产工厂，具有生长速度快、易培养，遗传背景清晰，基因操作简单等特点，因此成为了研究最为广泛和深入的模式微生物。2017年wei zhou等人通过对大肠杆菌bl21(de3)生产l-苯丙氨酸竞争途径的敲除获得l-苯丙氨酸生产菌株bphe，并将苯丙氨酸解氨酶(pal)、肉桂酰coa连接酶(4cl)、肉桂酰coa还原酶(ccr)及糖苷转移酶(ugt)基因在bphe菌株中过表达，获得rosin生产菌株bphe02，摇瓶发酵产量达到258mg/l。2019年huiping bi等人在bphe02菌株基础上过表达长春花糖苷转移酶(caugt3)基因，得到bphe-pdg菌株，最终通过摇瓶培养络缌产量为256.8mg/l，同时获得1107.9
±
109.2mg/l洛塞维。根据以上研究表明，依靠微生物法工业化生产络缌是一种行之有效的策略，与传统生产方法相比，降低了生产成本，环境污染小，且可持续发展，具有很好的应用前景。但是，现有的合成技术离络缌的工业化生产还有很大距离。因此，提高生物法合成络缌的产量成为必然趋势。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种通过代谢改造得到无质粒高产l-苯丙氨酸菌株，并以
此为基础重组外源基因，获得能够生产络缌的基因工程菌，该基因工程菌能够高产量生产络缌。本发明的第一个目的是提供一种生产络缌的重组大肠杆菌，所述的重组大肠杆菌以大肠杆菌w3110为底盘菌，通过代谢改造，得到高产l-苯丙氨酸的大肠杆菌wt3菌株。再以大肠杆菌wt3为宿主菌表达来源于粘红酵母(rhodotorula glutinis)的苯丙氨酸解氨酶(rgpal)、链霉菌(streptomyces aureus)的肉桂酰coa连接酶(sc4cl)、拟南芥(arabidopsis thaliana)的肉桂酰coa还原酶(atccr)和糖苷转移酶(atugt73c5)基因。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种四酶重组表达质粒，所述四酶重组表达质粒包含携带t7启动子的苯丙氨酸解氨酶基因、携带t7启动子的肉桂酰coa连接酶基因、携带t7启动子的肉桂酰coa还原酶基因和携带t7启动子的糖苷转移酶基因。每一个基因都单独表达，因此每一个基因前都携带t7启动子。
7.优选的，所述四酶重组表达质粒的载体为pet-28a。
8.进一步，所述苯丙氨酸解氨酶基因编码的氨基酸序列如seq id no:2所示；所述肉桂酰coa连接酶基因编码的氨基酸序列如seq id no:4所示；所述肉桂酰coa还原酶基因编码的氨基酸序列如seq id no:6所示；所述糖苷转移酶基因编码的氨基酸序列如seq id no:8所示。
9.优选的，所述苯丙氨酸解氨酶基因的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述肉桂酰coa连接酶基因的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述肉桂酰coa还原酶基因的核苷酸序列如seq id no:5所示；所述糖苷转移酶基因编码的核苷酸序列如seq id no:7所示。
10.在本发明的一个实施例中，将该四酶重组表达质粒记为pet-28a-p4cu。
11.第二方面，本发明提供一种上述四酶重组表达质粒构建的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主菌是对大肠杆菌w3110进行如下改造获得的：敲除tyrr基因、pykf基因、trpd基因和tyra基因；将galp基因的启动子、glk基因的启动子、ppsa基因的启动子和phea基因的启动子分别替换为trc启动子；将编码如seq id no:11所示氨基酸序列的phea基因突变为如seq id no:12所示氨基酸序列的phea
fbr
基因(即将phea蛋白第326位氨基酸由苏氨酸突变为脯氨酸，在本发明的一个实施例中是将phea基因第976位碱基由a突变为c)；以及将crr基因替换为携带lac启动子的t7rna聚合酶基因。
12.进一步，所述t7rna聚合酶基因编码如seq id no:10所示氨基酸序列。
13.进一步，所述t7rna聚合酶基因的核苷酸序列如seq id no:9所示。
14.将上述四酶重组表达质粒转入所述宿主菌即可获得用于发酵络缌的基因工程菌；在本发明的一个实施例中利用crispr/cas 9技术对大肠杆菌w3110进行改造。进一步地，所述的t7rna聚合酶基因以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板扩增而来，(genbank登录号：nc_001604.1)核苷酸序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.10所示。
15.第三方面，所述基因工程菌还含有其它表达苯丙氨酸解氨酶的重组质粒，当然是在前述宿主菌中能表达的重组质粒。
16.具体地，所述其它表达苯丙氨酸解氨酶的重组质粒是以pacyc-duet为表达载体构建的包含苯丙氨酸解氨酶(rgpal)基因的重组质粒pacyc-pal(抗性标记为氯霉素抗性)。
17.所述其它表达苯丙氨酸解氨酶的重组质粒所含苯丙氨酸解氨酶基因所编码的氨基酸序列如seq id no:2所示，核苷酸序列如seq id no:1所示，是将如seq id no:1所示基
因序列插入pacyc-duet载体得到的。
18.仅仅将pet-28a-p4cu转入大肠杆菌wt3(上述改造过的大肠杆菌w3110)能完成络缌的表达。pacyc-pal能进一步提高表达量。
19.将所述的两个重组质粒转化到大肠杆菌wt3，获得重组大肠杆菌wrp1，通过本发明提供的基因工程菌获得的如上产物的产量较高，可达克级。
20.进一步地，苯丙氨酸解氨酶基因rgpal(genbank登录号：auq35650.1)的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。肉桂酰coa连接酶基因sc4cl(genbank登录号：kr780667.1)的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。肉桂酰coa还原酶基因atccr(genbank登录号：nm_101463.4)的氨基酸序列如seq id no.5所示，核苷酸序列如seq id no.6所示。糖苷转移酶基因atugt73c5(genbank登录号：nm_129235.4)的核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。
21.第四方面，本发明还提供一种上述基因工程菌在生产络缌中的应用。
22.所述应用既可以在实验室摇瓶生产，也可以在工厂中利用发酵罐生产。
23.在本案的一个实施例中，所述应用为：将所述基因工程菌接种到含抗生素的lb液体培养基中37℃、180rpm条件下培养12h获得种子液，所述种子液以1％的体积接种量接入新鲜的含抗生素的lb液体培养基，在37℃、180rpm条件下培养至od600＝0.8时加入终浓度为0.1mm的iptg，在20℃下诱导培养14h，离心收集菌体，所得湿菌体转入发酵培养基中于30℃、180rpm发酵48h生产络缌。
24.进一步，所述发酵培养基的终浓度组成为：葡萄糖20g/l，酵母提取物2g/l，kh2po
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，(nh4)2so
4 16g/l，caco
3 5g/l，mnso
4 0.01g/l，feso
4 0.01g/l，溶剂为水，ph自然。
25.采用上述重组大肠杆菌发酵生产络缌。
26.进一步具体地，将所述基因工程菌接种至含抗生素的lb固体培养基上培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于含抗生素的lb液体培养基中，于37℃、180rpm条件下培养12h，得到种子液；按1％的体积接种量将所述种子液接种至含抗生素的lb液体培养基中，在37℃、180rpm条件下培养，当od600＝0.8时加入终浓度为0.1mm的iptg在20℃条件下诱导14h，诱导结束后，离心收集菌体，并用发酵培养基悬浮并全部转移至发酵培养基，于30℃、180rpm发酵48h生产络缌。
27.在本案的一个实施例中，所述应用为(发酵罐发酵条件)：将所述基因工程菌接种到含抗生素的lb液体培养基中37℃、180rpm条件下培养12h获得第一阶段种子液，按1％体积接种量接入到装有lb液体培养基的锥形瓶中，于37℃、180rpm培养12h，所得第二阶段种子液按照10％接种量转入装有液体培养基的发酵罐中，通气量1vvm，于37℃培养，至od600达到10时，加入终浓度为0.1mm的iptg，20℃下诱导培养14h后加入终浓度为20g/l葡萄糖，30℃下发酵60h制备；发酵过程中随着葡萄糖和酵母粉消耗适量补加葡萄糖和酵母粉，使葡萄糖浓度维持在5-10g/l，每次补加的酵母粉的质量约为补加的葡萄糖的质量的8％。
28.发酵罐发酵培养基：胰蛋白胨15g/l，酵母提取物5g/l，na2hpo4·
12h2o 15.12g/l，kh2po
4 3g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，cacl
2 0.011g/l，nh4cl 1g/l，溶剂为水，ph自然。
29.发酵罐葡萄糖补料：葡萄糖600g/l，酵母提取物50g/l。
30.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
31.本发明以大肠杆菌w3110为底盘细胞，通过代谢改造，得到l-苯丙氨酸高产大肠杆菌wt3菌株。再以大肠杆菌wt3为宿主菌表达来源于粘红酵母的苯丙氨酸解氨酶(rgpal)、链霉菌的肉桂酰coa连接酶(sc4cl)、拟南芥的肉桂酰coa还原酶(atccr)和糖苷转移酶(atugt73c5)基因，构建的重组大肠杆菌能够以葡萄糖为底物实现微生物法从头合成络缌，其成本低廉且产量高，摇瓶发酵达到597mg/l，比目前报道最高产量258mg/l多131％，在5l发酵罐中产量达到4.01g/l。
附图说明
32.图1大肠杆菌wp1-wp4和wt1-wt3菌株摇瓶发酵l-苯丙氨酸的产量；
33.图2大肠杆菌wrp1菌株中重组质粒示意图；
34.图3大肠杆菌wb1,wr1和wrp1菌株摇瓶发酵络缌产量；
35.图4大肠杆菌wrp1菌株发酵罐发酵生产络缌产量；
36.图5大肠杆菌wrp1菌株代谢途径改造示意图。
具体实施方式
37.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
38.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
39.下述实施例中所涉及的培养基如下：
40.lb培养基配方：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl 10g/l，固体培养基另加1.5％-2.0％琼脂粉。
41.摇瓶发酵培养基：葡萄糖20g/l，酵母提取物2g/l，kh2po
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，(nh4)2so
4 16g/l，caco
3 5g/l，mnso
4 0.01g/l，feso
4 0.01g/l。
42.发酵罐发酵培养基：胰蛋白胨15g/l，酵母提取物5g/l，na2hpo4·
12h2o 15.12g/l，kh2po
4 3g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，cacl
2 0.011g/l，nh4cl 1g/l。
43.发酵罐葡萄糖补料：葡萄糖600g/l，酵母提取物50g/l。
44.苯丙氨酸及络缌检测方法，采用高效液相色谱(hplc)检测。
45.苯丙氨酸色谱检测条件具体如下：welch c18色谱柱(4.6
×
250mm，孔径为5μm)；流动相为：ph＝6.0磷酸盐缓冲液：甲醇＝3：7；流速0.6ml/min；进样量10μl；紫外检测器，检测波长257nm；柱温为30℃。
46.络缌色谱检测条件具体如下：welch c18色谱柱(4.6
×
250mm，孔径为5μm)；流动相为：乙腈：甲醇：水：乙酸＝36：6：57.98：0.02；流速1ml/min；进样量10μl；紫外检测器，检测波长205nm；柱温为30℃。
47.实施例1
48.1.高产l-苯丙氨酸大肠杆菌wt3菌株构建
49.通过crispr/cas 9技术对大肠杆菌w3110进行基因编辑，敲除tyrr基因得到大肠杆菌wp1菌株，接着敲除pykf基因得到大肠杆菌wp2菌株，接着敲除trpd基因得到大肠杆菌wp3菌株，接着敲除tyra基因得到大肠杆菌wp4菌株；接着替换galp基因原启动子为trc启动
子，替换glk基因原启动子为trc启动子再替换crr基因为lac启动子加t7rna聚合酶基因得到大肠杆菌wt1菌株；替换基因ppsa原启动子为trc启动子得到大肠杆菌wt2菌株；替换phea基因和其原启动子分别为phea
fbr
基因和trc启动子得到高产苯丙氨酸大肠杆菌wt3。
50.2.crispr/cas 9敲除基因的操作，以tyrr基因为例
51.(1)大肠杆菌w3110/pcas化转感受态制备
52.将50ng pcas质粒，42℃，热激90sec转化到大肠杆菌w3110感受态细胞，涂于固体lb培养基(100mg/l卡那霉素(kana))在培养箱30℃过夜培养，获得大肠杆菌w3110/pcas菌株，挑取单菌落，接种于5ml lb试管培养基(100mg/l kana)，并加入50μl 1m l-阿拉伯糖(l-ara)溶液，30℃，180rpm过夜培养，获得种子液。取500μl种子液接种于50ml lb培养基(100mg/l kana)，并加入500μl 1m l-ara溶液，30℃，180rpm培养至od600＝0.4-0.6，冰浴5min，在超净台将菌液倒入50ml无菌离心管，8℃，5000rpm离心10min，在超净工作台，弃上清，加入20ml预冷的100mm cacl2重悬菌体，冰浴30min，冰浴结束，8℃，5000rpm离心10min，无菌操作弃去上清，加入0.5ml预冷的100mm cacl2溶液及60％甘油，将菌体重悬，每支50μl分装于无菌1.5ml ep管，-80℃保存。
53.(2)donor dna制备
54.获取上游同源臂片段，扩增体系：1μl浓度50ng/μl的大肠杆菌w3110基因组dna为模板，10μm的引物tyrr-f1和tyrr-r1(表1)各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr扩增完成后，经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，利用pcr purification kit纯化获得上游同源臂片段。
55.下游同源臂片段获取方式参考上游同源臂片段，引物为tyrr-f2/tyrr-r2(表1)。
56.使用overlap pcr，获得donordna，扩增体系：50ng/μl的上、下游同源臂片段各1μl为模板，10μm的引物tyrr-f1和tyrr-r2各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 21μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。
57.(3)sgrna制备
58.依据crispr/cas 9基因编辑原理，设计定点突变引物，将原始sgrna突变为特异性引导sgrna序列。扩增的体系：1μl 50ng/μl的ptarget-x质粒dna为模板，浓度10μm的引物ptar(tyrr)-f和引物ptar(tyrr)-r)各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，2min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，纯化后片段利用dpn i酶切体系消化模板dna，酶切体系：quickcut dpn i 1μl，10
×
buffer 3μl，37℃反应2.5h，反应结束后使用pcr purification kit纯化回收至20μl。取5μl取纯化产物转化大肠杆菌dh5a菌感受态细胞，使用lb平板(50mg/l盐酸壮观霉素(sd))筛选并测序验证。将正确突变的菌株接种于10ml试管lb液体培养基(50mg/l sd)，37℃、180rpm培养12h，获得菌液，并提取质粒记为ptarget-tyrr，保存于-20℃。
59.(4)基因编辑操作
60.从-80℃取携带pcas质粒的感受态细胞，冰浴静置2min，加入500ng donor dna和
50ng ptarget-tyrr，轻轻混匀冰上静置30min。静置结束后42℃热激90s后冰浴静置2min，静置结束向感受态中加入1ml预冷的lb培养基置于摇床30℃，180rpm孵育2h。孵育完成后取100μl涂布于lb固体培养基(50mg/l sd+100mg/l kana)，30℃过夜培养。
61.在转化平板上挑取若干单克隆作为模板，以tyrr-tf/tyrr-tr为引物，进行菌落pcr验证，阳性克隆被用于进一步消除ptarget-tyrr质粒。
62.(5)ptarget-tyrr质粒消除
63.将阳性克隆接种于5ml lb液体培养基(100mg/l kana)，加入终浓度为0.1mm的iptg诱导pcas质粒消除ptarget-tyrr质粒，30℃，180rpm培养16h，接着在lb固体培养基(100mg/l kana)上划线，30℃过夜培养。挑取单菌落(此处挑菌只挑取单菌落大小的一半)并编号，按编号接种于lb固体培养基(50mg/l sd)上对应的编号区域，30℃过夜培养。在lb固体培养基(50mg/l sd)对应区域不能生长的单菌落为ptarget-tyrr成功消除菌株。若进行下一轮基因编辑则将成功消除ptarget-tyrr菌株再次制备为携带pcas质粒化转感受态细胞。
64.(6)pcas质粒消除
65.所有基因编辑结束后将pcas质粒消除，完成菌株构建，以进行后续的发酵培养等试验。
66.将ptarget-tyrr成功消除的单菌落接种于5ml lb培养基，37℃，180rpm培养16h。取10μl培养的菌液划线于lb固体培养基，37℃过夜培养。培养完成后将划线单菌落编号，挑取编号的单菌落(此处挑菌只挑取单菌落大小的一半)接种于lb固体培养基(100mg/l kana)上对应的区域，30℃过夜培养，在lb固体培养基(100mg/l kana)对应区域不能生长的单菌落为pcas成功消除菌株。pcas消除的菌株为完成编辑的工程菌株，将其接种于lb液体培养基在37℃，180rpm摇床过夜培养，并将菌株保藏于-80℃用于后续实验操作。
67.3.后续基因编辑若为基因敲除则参考tyrr基因敲除操作流程，按照表1中各个引物与上述基因敲除操作对应的编号进行操作。
68.4.crispr-cas 9替换基因启动子的操作，以galp基因为例。
69.galp原启动子替换属于基因替换，相比tyrr基因敲除区别在于，需在构建donordna步骤中以trc启动子片段为模板，以galp-f3/galp-r3(表1)为引物，扩增的体系：1μl 50ng/μl的ptrc99a质粒为模板，浓度10μm的引物galp-f和引物galp-r3各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。随后以目的基因与上、下游同源臂片段为模板，以galp-f1/galp-r2(表1)为引物，利用overlap pcr将三个片段融合为所需donordna，其余步骤参考tyrr基因敲除。
70.5.crispr-cas 9对phea抗反馈抑制点突变及替换启动子的操作。
71.phea抗反馈抑制点突变及替换启动子属于基因替换，首先是抗反馈抑制目的基因phea
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的构建，即将phea序列的第976位碱基由a突变为c，326位氨基酸由苏氨酸突变为脯氨酸。具体过程：首先扩增phea1片段，扩增体系：1μl浓度50ng/μl的大肠杆菌w3110基因组dna为模板，10μm的引物phea-f3和phea-r3(表1)各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr扩增完成后，经1％琼脂糖凝胶电泳验
证正确的pcr产物，利用pcr purification kit纯化获得phea1片段。phea2片段获取方式参考phea1片段，引物为phea-f4/phea-r4。其次使用overlap pcr，获得phea
fbr
片段，扩增体系：50ng/μl的上、下游同源臂片段各1μl为模板，10μm的引物phea-f3和phea-r4各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 21μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，利用pcr purification kit纯化获得目的基因phea
fbr
片段。随后以目的基因phea
fbr
与上、下游同源臂片段为模板，以phea-f1/phea-r2(表1)为引物，利用overlap pcr将三个片段融合为所需donordna，其余步骤参考tyrr基因敲除。
72.6.crispr-cas 9对lac启动子加t7rnap基因插入crr基因的操作。
73.t7rnap基因插入crr基因属于基因替换，以大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板以crr-f3/crr-r3(表1)为引物，扩增lac启动子加t7rnap基因，扩增体系：1μl浓度50ng/μl的大肠杆菌bl21(de3)基因组为模板，10μm的引物crr-f3和crr-r3(表1)各1μl，2
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primestar max premix 25μ合，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr扩增完成后，经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，利用pcr purification kit纯化获得t7rnap基因目的片段，其余步骤参考galp基因替换启动子的操作。
74.表1：基因编辑引物
75.76.77.[0078][0079]
7.重组质粒pet-28a-p4cu的构建
[0080]
rgpal、sc4cl、atccr及atugt73c5目的基因经北京擎科生物科技有限公司优化后合成，分别构建在puc57载体的ecorⅰ及hindⅲ限制性核酸酶酶切位点之间。线性化pet-28a载体，扩增的体系：1μl 50ng/μl的pet-28a载体dna为模板，浓度10μm的引物pet28a-f1和pet28a-r1(表2)各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，3min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，纯化后片段利用dpn i酶切体系消化模板dna，酶切体系：quickcut dpn i 1μl，10
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buffer 3μl，线性化pet-28a质粒dna 26μl。37℃
反应2.5h，反应结束后使用pcr purification kit纯化回收至20μl。rgpal基因的获得，扩增的体系：1μl 50ng/μl的puc57-rgpal基因为模板，浓度10um的引物pal-f1和引物pal-r1各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，再利用clonexpress
ꢀⅱꢀ
one step cloning kit试剂盒一步克隆将线性化pet-28a及rgpal连接，连接体系：1μl 60ng/μl的rgpal基因，2μl 60ng/μl线性化pet-28a质粒，4μl 5
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buffer，2μl clonexpress
ꢀⅱꢀ
one step cloning kit c112，用ddh2o补足到20μl，37℃反应30min。连接完成进行转化并菌落pcr验证，筛选阳性转化子并提取质粒测序验证其序列正确性，得到pet-28a-pal质粒。sc4cl基因的获得，扩增的体系：1μl 50ng/μl的puc57-sc4cl质粒为模板，浓度10μm的引物4cl-f1和引物4cl-r1各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，得到sc4cl基因片段，其余步骤参考pet-28a-pal质粒构建，制备pet-28a-4cl质粒。atccr基因的获得，扩增的体系：1μl 50ng/μl的puc57-atccr质粒为模板，浓度10μm的引物ccr-f1和引物ccr-r1各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，得到atccr基因片段，其余步骤参考pet-28a-pal质粒构建，制备pet-28a-ccr质粒。atugt73c5基因的获得，扩增的体系：1μl 50ng/μl的puc57-atugt73c5质粒为模板，浓度10μm的引物ugt-f1和引物ugt-r1各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，得到atugt73c5基因片段，其余步骤参考pet-28a-pal质粒构建，制备pet-28a-ugt质粒。
[0081]
pt7-sc4cl基因的获得，扩增的体系：1μl 50ng/μl的pet-28a-4cl质粒为模板，浓度10μm的引物4cl-f2和引物4cl-r2各1μl，2
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primestar max premix25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，得到pt7-sc4cl基因。pt7-atccr基因的获得，扩增的体系：1μl50ng/μl的pet-28a-ccr质粒为模板，浓度10um的引物ccr-f2和引物ccr-r2各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，得到pt7-atccr基因。携带t7启动子的sc4cl和atccr串联基因pt7-sc4cl-pt7-atccr的获得，扩增体系：50ng/μl的pt7-sc4cl和pt7-atccr基因各1μl为模板，浓度10μm的引物4cl-f2
和引ccr-r2各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 21μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，2min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl。线性化pet-28a-pal质粒，扩增体系：1μl 50ng/μl的pet-28a-pal载体dna为模板，浓度10μm的引物pet28a-f2和引物pet28a-r2各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，3min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，纯化后片段利用dpn i酶切体系消化模板dna，酶切体系：quickcut dpn i 1μl，10
×
buffer 3μl，线性化pet-28a-pal质粒dna26μl，37℃反应2.5h，反应结束后使用pcr purification kit纯化回收至20μl。线性化pet-28a-pal与pt7-sc4cl-pt7-atccr的连接，连接体系：2μl 60ng/μl的pt7-sc4cl-pt7-atccr基因，2μl60ng/μl线性化pet-28a-pal质粒，4μl 5
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buffer，2μl clonexpressⅱone step cloning kit c112，用ddh2o补足到20μl，37℃反应30min。连接完成进行转化并菌落pcr验证，筛选阳性转化子并提取质粒测序验证其序列正确性，得到pet-28a-pal-4cl-ccr质粒。
[0082]
线性化pet-28a-pal-4cl-ccr质粒，扩增的体系：1μl 50ng/μl的pet-28a-pal-4cl-ccr载体dna为模板，浓度10μm的引物pet28a-f3和引物pet28a-r3各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，3min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，纯化后片段利用dpn i酶切体系消化模板dna，酶切体系：quickcut dpn i 1μl，10
×
buffer 3μl，线性化pet-28a-pal-4cl-ccr质粒dna26μl，37℃反应2.5h，反应结束后使用pcr purification kit纯化回收至20μl。获取pt7-atugt73c5基因，扩增的体系：1μl 50ng/μl的pet-28a-ugt质粒为模板，浓度10μm的引物ugt-f2和引物ugt-r2各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl。连接线性化的pet-28a-pal-4cl-ccr质粒片段与pt7-atugt73c5，连接体系：1μl 60ng/μl的pt7-atugt73c5基因，3μl 60ng/μl线性化pet-28a-pal-4cl-ccr质粒，4μl 5
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buffer，2μl clonexpressⅱone step cloning kit c112，用ddh2o补足到20μl，37℃反应30min。连接完成进行转化并菌落pcr验证，筛选阳性转化子并提取质粒测序验证其序列正确性，得到pet-28a-pal-4cl-ccr-ugt质粒，将其命名为pet-28a-p4cu。
[0083]
8.重组质粒pacyc-pal的构建
[0084]
线性化pacyc-duet质粒，扩增的体系：1μl 50ng/μl的pacyc-duet载体dna为模板，浓度10μm的引物pacyc-f1和引物pacyc-r1(表2)各1μl，2
×
primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，3min；共30个循环，终止温度为4℃。pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，纯化后片
段利用dpn i酶切体系消化模板dna，酶切体系：quickcut dpn i 1μl，10
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buffer 3μl，线性化pacyc-duet质粒dna 26μl，37℃反应2.5h，反应结束后使用pcr purification kit纯化回收至20μl。
[0085]
获取rgpal基因，扩增的体系：1μl 50ng/μl的puc57-rgpal质粒为模板，浓度10μm的引物pal-f4和pal-r4(表2)各1μl，2
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primestar max premix 25μl，ddh2o 22μl。pcr反应条件为：预变性98℃，5min，然后进入温度循环98℃，10sec；57℃，15sec；72℃，1min；pcr结束后经1％琼脂糖凝胶电泳验证正确的pcr产物，使用pcr purification kit将pcr体系回收纯化至30μl，连接线性化的pacyc-duet质粒和rgpal，连接体系：1μl 60ng/μl的rgpal基因，2μl 60ng/μl线性化pacyc-duet质粒，4μl 5
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buffer，2μl clonexpressⅱone step cloning kit c112，用ddh2o补足到20μl，37℃反应30min。连接完成进行转化并验证，筛选阳性转化子并提取质粒测序验证其序列正确性，得到pacyc-pal质粒。
[0086]
表2：pet-p4cu及pacyc-pal载体构建引物
[0087]
0.1mol/l cacl2溶液。每份100μl分装与于1.5ml的ep管中于-80℃储存备用。
[0091]
(2)将所构建的pet-28a-p4cu重组质粒化转导入大肠杆菌wt3感受态细胞中，涂布于lb固体培养基(100mg/l kana)，于37℃培养至长出转化子。菌落pcr验证，验证正确的菌株进行甘油管保藏，得到重组大肠杆菌wt3/pet-28a-p4cu，将该菌株命名为wr1。
[0092]
(3)制备大肠杆菌wr1感受态细胞：将大肠杆菌wr1菌株接种至lb固体培养基(100mg/l kana)上划线培养，挑取单菌落接种于50ml lb液体培养基(100mg/l kana)，37℃、180rpm养12h左右，制得种子液。以1％接种量将种子液接种至50ml lb液体培养基(100mg/l kana)，37℃、180rpm培养至od600＝0.6-0.8，冰浴10min，4℃，5000rpm，离心5min收集菌体，将获得的菌体用20ml 0.1mol/l预冷的无菌cacl2溶液悬浮菌体冰浴30min，4℃，5000rpm离心5min，去上清收集菌体并加入800μl 0.1mol/l cacl2溶液。每份100μl分装与于1.5ml的ep管中于-70℃储存备用。
[0093]
(4)将所构建的pacyc-pal重组质粒采用化转导入wr1感受态细胞中，涂布于lb固体培养基(100mg/l kana+100mg/l氯霉素(chl))，37℃过夜培养。将转化子利用菌落pcr验证，阳性菌株即为重组大肠杆菌wrp1。
[0094]
10.对照重组大肠杆菌菌株wb1的构建
[0095]
(1)制备大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞：将大肠杆菌bl21(de3)菌株接种至lb固体培养基上划线培养，挑取单菌落于50ml lb液体培养基，37℃、180rpm培养12h，获得种子液。将种子液以1％接种量接种至50ml lb液体培养基，37℃、180rpm培养至od
600
＝0.6-0.8时，冰浴10min后于4℃下5000rpm离心5min收集菌体，将获得的菌体用20ml 0.1mol/l预冷的无菌cacl2溶液悬浮菌体冰浴30min，冰浴结束于4℃下5000rpm离心5min去上清收集菌体并加入800μl 0.1mol/l cacl2溶液。每份100μl分装与于1.5ml的ep管中于-80℃储存备用。
[0096]
(2)将所构建的pet-28a-p4cu重组质粒化转导入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于lb固体培养基(100mg/l kana)，于37℃培养至长出转化子。菌落pcr验证，验证正确的菌株进行甘油管保藏，得到重组大肠杆菌wb1。
[0097]
实施例2：摇瓶发酵生产苯丙氨酸及络缌
[0098]
(1)将实施例1制备得的代谢改造大肠杆菌菌株wp1-wp4和wt1-wt3接种于50ml lb液体培养基，37℃、180rpm培养12h；制备得到种子液。
[0099]
(2)将步骤(1)制备得到的种子液按体积比1％的接种量接入到50ml lb液体培养基，37℃、180rpm培养，当od600＝0.8时，加入终浓度为0.1mm iptg进行诱导。
[0100]
(3)将步骤(2)得到的诱导后菌液4000rpm离心5min收集菌体，使用3ml发酵培养基将菌体重悬后转入50ml发酵培养基，30℃，180rpm培养48h。
[0101]
48h取样通过hplc检测l-苯丙氨酸含量，大肠杆菌wp1-wp4,wt1-wt3菌株苯丙氨酸产量结果如图2所示(数据见表3)。
[0102]
表3大肠杆菌wp1-wp4,wt1-wt3菌株摇瓶发酵苯丙氨酸的产量
[0103][0104]
(4)制备得到的重组大肠杆菌wrp1菌株接种于50ml lb液体培养基(100mg/l kana+100mg/l chl)，wb1和wr1菌株接种于50ml lb液体培养基(100mg/l kana)，37℃、180rpm培养12h；制备得到种子液。
[0105]
(5)将步骤(4)制备得到的种子液按体积比1％的接种量接入到相应抗性的50ml lb液体培养基，37℃、180rpm培养，当od600＝0.8时加入终浓度为0.1mm iptg于20℃、180rpm诱导12h。
[0106]
(6)将步骤(5)得到的诱导后菌液4000rpm离心5min收集菌体，使用3ml发酵培养基将菌体悬浮并转入发酵培养基，30℃、180rpm培养48h。48h取样通过hplc检测产物含量，络缌产量结果如图3所示(数据见表4)。
[0107]
表4大肠杆菌wb1，wr1和wrp1菌株摇瓶发酵络缌产量。
[0108][0109]
实施例3：发酵罐发酵生产络缌
[0110]
(1)制备得到的大肠杆菌wrp1菌株接种于50ml lb液体培养基(100mg/l kana+100mg/l chl)，37℃、180rpm培养12h；制备得到第一阶段种子液；
[0111]
(2)将步骤(1)制备得到的种子液按体积比1％的接种量接入100ml lb液体培养基(100mg/l kana+100mg/l chl)中，37℃、180rpm培养12h，得到第二阶段种子液；
[0112]
(3)将步骤(2)制备得到的第二阶段种子液按照体积比10％的接种量转入装有1.8l发酵培养基(100mg/l kana+100mg/l chl)的5l发酵罐中，在温度37℃，通气比1vvm，溶
氧40％，ph＝7.0条件下培养至od
600
达到10-11时加入终浓度为0.1mm的iptg，在20℃下诱导培养16h后，30℃下发酵60h，得到含有络缌的发酵液。30℃用5m氨水流加调节ph；诱导培养16h后葡萄糖控制在5-10g/l，通过流加600g/l葡萄糖流加液控制。
[0113]
诱导结束后，每隔4h左右取样检测od600和络缌产量。结果如图4所示(数据见表5)。
[0114]
表5发酵罐wrp1菌株不同发酵时间的络缌产量及od600。
[0115][0116]
表6：本发明所涉及的质粒
[0117][0118][0119]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。