鉴定白肉灵芝云白灵芝2号品种的特异性分子标记及方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及利用分子生物学手段鉴别“云白灵芝2号”品种的方法及其特异性分子标记。


背景技术：

2.白肉灵芝ganoderma leucocontextum 又称为白灵芝、藏白灵芝、藏灵芝，属于担子菌门 basidiomycota，伞菌纲 agaricomycetes，多孔菌目 polyporales，灵芝科ganodermataceae，灵芝属ganoderma，是我国西南地区灵芝属的重要种类之一。目前，白肉灵芝主要在西南高海拔地区栽培，由于其菌肉洁白，被视为高品质的灵芝种类，多糖和三萜等活性成分含量高，有调节免疫、抗肿瘤、抗癌等功效，市场开发前景广阔。
3.云南白灵芝为白肉灵芝的一种，是生长在云南2 500 m以上高海拔地区的灵芝种类，是少有的低温型灵芝种质资源，本专利发明人团队多年来对采集的云南白灵芝种质资源开展生物学特性研究与驯化栽培试验，获得多个菌株，使野生、稀少、季节性强的云南白灵芝获得人工栽培(田果廷等, 2014)。“云白灵芝2号”是其中一个遗传稳定性高且具有优良性状的菌株，于2022年1月获得云南省品种鉴定证书。
4.白肉灵芝的栽培起步较晚，2014年才开始有栽培报道(谢荣等, 2014; 熊卫萍, 2016)，育成品种少。白肉灵芝栽培品种的真实性问题一直是制约其栽培成功率的主要因素之一(黄龙花等, 2017)。由于灵芝生长环境的差异，长期人工栽培、杂交等因素，使灵芝菌种的分类与鉴定出现混乱状况。
5.大型真菌传统的分类鉴定主要依据子实体的形态学特征来进行，但是子实体的许多形态学特征往往随着生长条件的不同而发生变化，这给传统的分类学带来了很大的困难。随着分子生物学技术的发展，各种分子标记技术已广泛应用于品种鉴定(周延清, 2005)。ssr-pcr (simple sequence repeats pcr)技术是一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna (microsatellite dna)技术，广泛用于遗传图谱的构建、目标基因的标定、指纹图谱的绘制、品种鉴定、群体间遗传距离分析、进化和遗传多样性等研究中。分子标记法是以菌株的遗传物质为依据，菌种鉴别上更具有可靠性。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的是为鉴定
‘
云白灵芝2号’提供一段特异性dna标记片段及引物序列，为实现该目的，本发明提供“云白灵芝2号”品种鉴定特异性标记基因ling2，ling2的核苷酸序列如seq idno.1所示。
7.进一步的，提供一种如seq idno.2所示的寡核苷酸引物，其中所述引物与具有seq idno.3序列的寡核苷酸引物结合能够扩增ling2基因的序列片段。
8.进一步的，提供一种如seq idno.3所示的寡核苷酸引物，其中所述引物与具有seq idno.2序列的寡核苷酸引物结合能够扩增ling2基因的序列片段。
9.进一步的，提供一种测定ling2基因表达的引物对，所述引物对由seq idno.2和
seq idno.3所示序列的引物组成。
10.进一步的，提供一种检测ling2基因表达的试剂盒，所述试剂盒含有seq idno.2和seq idno.3所示序列的引物组成的引物对。
11.本发明还提供了由seq idno.2和seq idno.3所示序列组成的分子特异性标记引物在鉴别“云白灵芝2号”品种中的应用的具体步骤：（1）提取待测灵芝品种的总基因组dna；（2）以步骤（1）提取的待测样品dna为扩增模板，以seq idno.2和seq idno.3所示序列组成的分子特异性标记引物作为扩增引物，进行pcr扩增；（3）对步骤（2）的pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现ling2基因片段，则待测样品为“云白灵芝2号”品种，反之则不是。
12.进一步的，pcr扩增体系为：2
×
tsingke master mix 17 μl，10 μmol/l引物各1 μl，模板dna 1 μl，ddh2o调整体系至25 μl。
13.进一步的，扩增程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，63℃退火10 s ，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃ 5 min延伸。
14.本发明在保存和分离选育自云南多个生境的15个白肉灵芝菌株进行分子鉴定和遗传多态性分析的基础上，获得“云白灵芝2号”特异性dna片段ling2，由此开发设计特异性分子标记引物序列如seq idno.2和seq idno.3所示，通过使用该特异性分子标记引物若为其他白肉灵芝品种dna，则pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后反应为阴性，进而实现在白肉灵芝种内成功快速、准确的鉴别该品种，为“云白灵芝2号”的新品种审定和保护提供了技术基础。
附图说明
15.图1 16个菌株ssr-pcr扩增多态性指纹图谱，（注：
↙
标注为1号样品“云白灵芝2号”的特异性dna片段）；图2分子标记ygl2f/ygl2r对16个菌株的特异性扩增（注：
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标注为1号样品“云白灵芝2号”的特异性dna片段）；图3分子标记ygl2f/ygl2r对“云白灵芝2号”的特异性扩增。
具体实施方式
16.下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明，所用试剂和样品均可以从市场购买。
17.‘
云白灵芝2号’(yblz2)是由一株野生白肉灵芝，经常规育种系统选育获得。产量高；品质优：多糖与总三萜含量较高；具有较好的商品性；抗杂性强、抗病性好，综合性状优，云白灵芝2号菌种于2022年1月获得云南省新品种鉴定证书[滇鉴(食用菌)2022071号],是极具高原特色的白肉灵芝品种。
[0018]
白肉灵芝菌株-云白灵芝2号保藏名称为ganodermaleucocontextum yblz2，于2020年10月26日保藏于国家微生物资源平台-中国农业微生物菌种保藏管理中心（accc），编号zy-1-7-2020-18/20100827(accc入库编号53308)，保藏地址：北京市中关村南大街12号。
[0019]
实施例11、供试材料供试菌株为灵芝属共16个菌株如表1所示，由市场获得后保存于云南省农业科学院菌种库。其中14个
‘
云白灵芝’菌株为灵芝属白肉灵芝不同种菌株，来源于云南省各州市，另外1个白肉灵芝对照菌株为
‘
康定灵芝g31’来源于四川省甘孜州，1个同属外缘菌株为赤芝。
[0020]
菌种基因组dna提取及ssr-pcr引物扩增与分析1）各菌种转接入ypd培养皿中，25 ℃暗培养6～8 d，直至其菌丝体长满。刮取菌丝体，液氮研磨，用试剂盒biomiga (fungal gdna isolation kit)提取基因组dna并保存。
[0021]
2）随机选取50对引物（参考文献：姚春馨，陈卫民，柴红梅，田果廷．云南白灵芝菌株分子鉴定及ssr遗传多样性分析．分子植物育种），对供试菌株dna做ssr-pcr扩增，扩增体系为：2
×
tsingke master mix (blue) 17 μl，10 μmol/l引物各1 μl，模板dna 1 μl (50 ng)，ddh2o调整体系至25 μl。扩增程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，63℃退火10 s ，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃ 5 min延伸。
[0022]
3）产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，成像后从不同引物对16个菌株的ssr扩增胶图中，分析清晰和特异的条带，获得含有“云白灵芝2号”特异性dna片段的多态性指纹图谱(如图1所示)。
[0023]
云白灵芝2号品种的特异性分子标记的设计1）采用传统的分子标记法，将获得的“云白灵芝2号”特异性dna片段进行切胶回收、载体克隆、测序，得到长541bp的特异序列ling2 ，ling2的核苷酸序列如seq idno.1所示。
[0024]
方法为：选择图1-胶图上做标记的清晰条带，做切胶回收纯化，纯化产物连接于pmd18-t载体，并转化入e.coli大肠杆菌dh5a感受态细胞。经引物扩增菌液验证为阳性克隆后，取新鲜菌液对载体插入片段进行测序，序列进行拼接与去除整理。
[0025]
2）基于该dna序列，在ncbi数据库中用blast软件进行同源比较，将ncbi数据库中有相对应的功能片段及和已知物种相似的假设蛋白编码片段整理列表。用primer 5.0软件对所有得到的差异片段设计特异引物，引物合成和扩增产物测序由擎科生物(昆明)完成。
[0026]
获得“云白灵芝2号”分子标记引物：ygl2f/ygl2r。
[0027]
ygl2f：5
’‑
gaggaggcatcggaggatac
ꢀ‑3’
；ygl2r：5
’‑
gcagcagagaggaaggaaga
ꢀ‑3’
实施例2云白灵芝2号品种的特异性分子标记的验证16个灵芝菌株基因组dna作为模版，以ygl2f和ygl2r作为引物，扩增体系为：2
×
tsingke master mix (blue) 17 μl，10 μmol/l引物各1 μl，模板dna 1 μl (50 ng)，ddh2o调整体系至25 μl。扩增程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，63℃退火10 s ，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃ 5 min延伸。
[0028]
由图2可以看出，白肉灵芝新品种“云白灵芝2号”yblz2能够扩增出大小331bp的特异性片段，而其他白肉灵芝样品均没有扩增到该片段，这表明本发明的“云白灵芝2号yblz2”的特异性分子标记具有极高的特异性，可以用于“云白灵芝2号yblz2”在白肉灵芝不同品种间的快速鉴定。
[0029]
实施例3选取与“云白灵芝2号”相似的灵芝属不同物种12个样品和非灵芝属其他真菌1个样品，再次验证扩增片段的特异性和应用范围。
[0030]
样品及序号分别是：1.赤芝-1，2.赤芝-2，3.云白灵芝2号，4.云白灵芝2号（重复），5.黄灵芝-12，6.黄灵芝-18，7.灵芝-314，8.灵芝-317，9.亮盖灵芝-811，10.亮盖灵芝-812，11.云芝-1，12.云芝-2，13.血灵芝-y1，14.血灵芝-y2，15.茶树菇-y58。
[0031]
提取15个菌株基因组dna，以特异引物ygl2f和ygl2r作pcr扩增，扩增体系为：2
×
tsingke master mix (blue) 17 μl，10 μmol/l引物各1 μl，模板dna 1 μl (50 ng)，ddh2o调整体系至25 μl。扩增程序为：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，63℃退火10 s ，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃ 5 min延伸。产物进行3%琼脂糖凝胶电泳（2ul样品+6ul溴酚蓝），180v电压下30 min，并成像。
[0032]
由图3可以看出，特异引物ygl2f和ygl2r能够扩增出“云白灵芝2号”yblz2大小331bp的特异性片段，而其他不同物种的灵芝样品，以及非灵芝样品均没有扩增到该片段，这表明本发明的“云白灵芝2号yblz2”的特异性分子标记具有一定的灵敏性和稳定性，在白肉灵芝以外的灵芝物种间也具有极高的特异性，可以用于更大范围内“云白灵芝2号yblz2”的快速鉴定。
[0033]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。