一种β1，3葡聚糖及其制备方法与流程

一种
β
1，3葡聚糖及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及到一种β1，3葡聚糖及其制备方法。


背景技术：

2.β-葡聚糖是一类广泛存在于微生物、植物和动物体内的大分子多糖，主链结构由β-1，3-糖苷键连接，因其抗氧化性、免疫活性抗癌效果优越等被应用于日化、医药、农业等方面，但目前已有成熟的研究成果较少。因此，如何高效制备β-1，3-糖及探索其生物活性成为研究的热点和重点。
3.目前，生物方法降解β-葡聚糖主要运用酶解法，常用β-葡聚糖酶将长链大分子β-葡聚糖降解成小分子短链的多糖，从而增加水溶性，改善其生物活性，且酶解后水溶性较好的葡聚糖抗肿瘤活性和抗氧化活性也显著增强，但提取多糖后剩余的物质将无法被利用而丢弃，造成原材料的浪费。
4.微生物发酵法是生物转化法的一种，是指利用完整的微生物细胞作为生物催化剂，能够提高活性多糖的生产效率，原材料中的碳源、氮源、无机盐等能被微生物的生长所利用，但微生物不能直接利用多糖，从而能达到对多糖的纯化分离及富集的目的。
5.香菇是我国传统的著名食用菌，在世界上最早人工驯化栽培。香菇营养丰富，味道鲜美，被视为“菇中之王”。香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，香菇多糖中的活性成分是具有分支的β1，3葡聚糖，其具有良好的免疫激活和抗肿瘤活性。但目前关于多糖酶解与微生物发酵协同转化香菇多糖的相关研究鲜有报道。


技术实现要素：

6.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
7.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
8.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种β1，3葡聚糖的制备方法。
9.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
10.预处理香菇多糖、利用多酶体系酶解多糖、发酵酶解产物、产物分离纯化。
11.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述预处理香菇多糖，包括，将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再加蒸馏水得到悬浮液，调节ph至6.5后再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
12.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述利用多酶体系酶解多糖，包括，
13.取待酶解的香菇多糖过100目筛，加蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于恒温水浴锅中；
14.向待酶解溶液中先加入活化好的纤维素酶、木瓜蛋白酶反应得到混合酶解液a；
15.再将活化好的β-葡聚酶加入混合酶解液a中，置于微波炉中反应；
16.反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤，冷冻干燥后得到酶解产物备用。
17.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述纤维素酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚酶的质量比为1：1：1，其中，以香菇多糖质量总量计，各酶的添加量分别为香菇多糖的0.5％～2％。
18.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述置于微波炉中反应，其中，反应时间为20min，微波炉功率为700w。
19.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述发酵酶解产物，包括，
20.取酶解产物溶于蒸馏水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中并调节ph至6.5；将用于发酵的菌种接种于上述溶液中进行发酵，发酵36h后得到发酵液。
21.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述用于发酵的菌种为酿酒酵母菌，接种量为2～4％。
22.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述液体培养基由胰蛋白胨、葡萄糖、nacl、琼脂、蒸馏水配制。
23.作为本发明所述的一种优选方案，其中：所述产物的分离纯化，包括，
24.将上述发酵液离心取上清，加乙醇洗涤后冷藏过夜再次离心，再次加乙醇洗涤后冷藏过夜离心，最后得白色沉淀即为β-1，3葡聚糖。
25.本发明的再一目的是，克服现有技术中的不足，提供一种利用酶解发酵法制得的β1，3葡聚糖。
26.本发明有益效果：
27.本发明首先采用多酶体系对香菇多糖进行酶解，酶解过程中利用微波进行反应，微波引起细胞内部结构的变化，加速香菇多糖由外层细胞转移到酶解液中，加速多糖酶解过程；再利用酿酒酵母进行发酵，在提高多糖产量的同时实现对β-葡聚糖的纯化与富集，优化了多酶体系以及菌种发酵体系的反应条件，得到最优的酶解发酵协同转化香菇多糖的条件，可以明显提高多糖的提取率，缩短提取周期，同时制得的β-1，3葡聚糖抗氧化活性强、抑菌效果显著。
具体实施方式
28.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
29.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
30.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
31.本发明采用刚果红法测定产物的纯度；
32.本发明采用分光光度法测定产物抗氧化活性；
33.本发明采用滤纸片法分别测定了产物对金黄色葡萄球菌的抑制效果。
34.本发明中所用原料：
35.香菇：安徽燕之坊电子商务有限公司，普通市售；纤维素酶(酶活11000u/g、木瓜蛋白酶(酶活800000u/g)、果胶酶(酶活50000u/g)、中性蛋白酶(酶活50000u/g)：合肥盛润生物制品有限公司，普通市售；β-葡聚糖酶(酶活40000u/g)：湖北泰多源生物工程有限公司，普通市售；酿酒酵母菌：北京万佳首化生物科技有限公司，菌种编号为bwcc59811；本发明中其他涉及的原料，无特殊说明，均为普通市售。
36.实施例1
37.将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
38.称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
39.再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,在功率为700w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
40.称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；接种3％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液。
41.将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
42.实施例2
43.将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
44.称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
45.再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,分别在功率为500w、600w、700w、800w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
46.称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；接种3％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液。
47.将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
48.测定产物的纯度、抗氧化活性(自由基清除率)、抑菌性，结果如表1：
49.表1不同微波功率下制备的β-1，3葡聚糖的纯度及性能
[0050][0051]
由表1可以看出，随着微波功率的提高，使得香菇多糖的得率升高，即最终产物的纯度提高，但当功率超过700w时，多糖得率不升反降低，这是由于微波功率提高能使得分子的运动速度加快，加速香菇多糖由外层细胞转移到溶液中，但功率过高，容易使得多糖被碳化，最终得率反而不高。
[0052]
实施例3
[0053]
将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
[0054]
称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
[0055]
再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,在功率为700w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
[0056]
称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph分别至6.0、6.5、7.0、7.5；接种3％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液。
[0057]
将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
[0058]
测定产物的纯度、抗氧化活性(自由基清除率)、抑菌性，结果如表2：
[0059]
表2不同发酵液ph下制备的β-1，3葡聚糖的纯度及性能
[0060][0061]
由表2可以看出，多糖产量在一定程度上受发酵液起始ph的影响，当发酵液ph为6.5时，多糖纯度最高，可以认定在本发明中，6.5即为发酵的最适ph。
[0062]
实施例4
[0063]
将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
[0064]
称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
[0065]
再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,在功率为700w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
[0066]
称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；分别接种2.0％、2.5％、3.0％、3.5％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液。
[0067]
将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
[0068]
测定产物的纯度、抗氧化活性(自由基清除率)、抑菌性，结果如表3：
[0069]
表3不同发酵菌种接种量制备的β-1，3葡聚糖的纯度及性能
[0070][0071]
由表3可以看出，本发明优选了发酵过程中酵母菌的接种量，当接种量为3％时，产物纯度最高，接种量继续增加时，多糖产量反而有所下降。
[0072]
实施例5
[0073]
将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
[0074]
称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
[0075]
再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,在功率为700w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
[0076]
称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；接种3％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，分别发酵24、30、36、42h后得到发酵液。
[0077]
将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
[0078]
测定产物的纯度、抗氧化活性(自由基清除率)、抑菌性，结果如表4：
[0079]
表4不同发酵时间制备的β-1，3葡聚糖的纯度及性能
[0080][0081]
本发明通过调整发酵的时间，发现发酵36h时产物得率最高，同时抗氧化活性最强，所以确定本发明的最佳发酵时间为36h
[0082]
对比例1
[0083]
将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
[0084]
称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素果胶酶和1g中性蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
[0085]
再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,在功率为700w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
[0086]
称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；接种3％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液
[0087]
将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
[0088]
对比例2
[0089]
将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
[0090]
称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
[0091]
再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后置于微波炉中,在功率为700w的条件下继续反应20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
[0092]
称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；接种3％活化后的放线菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液。
[0093]
将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
[0094]
对比例3
[0095]
将香菇加水浸泡后磨成浆液，离心干燥后得到香菇粉末；将所得粉末加蒸馏水洗涤5次后再次离心，收集沉淀；重复上一步骤后再按照1：8的比例加蒸馏水得到悬浮液，用柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液调节ph至6.5；悬浮液再次抽滤干燥，得到待酶解的香菇多糖。
[0096]
称取100g待酶解的香菇多糖过100目筛加适量蒸馏水搅拌均匀得到待酶解溶液，置于50℃恒温水浴锅中，称取1g纤维素酶和1g木瓜蛋白酶溶于55℃蒸馏水中活化5min，活化后与待酶解溶液置于55℃恒温水浴锅反应10min得到混合酶解液a；
[0097]
再称取1gβ-葡聚糖酶溶于45℃蒸馏水中活化5min，活化后与酶解液a混合，充分混合后沸水浴加热20min，反应结束后趁热抽滤，取沉淀洗涤；冷冻干燥后得到酶解产物。
[0098]
称取10g胰蛋白胨、5g葡萄糖、10gnacl、20g琼脂、加1000mil蒸馏水制备液体培养基；取酶解产物溶于无菌水中，混合震荡使得酶解产物完全溶解，加入液体培养基中调节ph至6.5；接种3％活化后的酿酒酵母菌于上述溶液中进行摇瓶发酵，发酵36h后得到发酵液。
[0099]
将得到的发酵液进行离心，取上清液，用体积比为上清液2倍的75％乙醇进行洗涤，冷藏过夜后再次离心，取上清液，用体积比为上清液6倍的75％乙醇进行洗涤，再次冷藏过夜，离心得白色沉淀，即为β-1，3葡聚糖产品。
[0100]
测定产物的纯度、抗氧化活性(自由基清除率)、抑菌性，结果如表3：
[0101]
表5不同制备工艺下的β-1，3葡聚糖的纯度及性能
[0102][0103][0104]
本发明首先采用多酶体系对香菇多糖进行酶解，选用纤维素酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚酶组成多酶催化体系，先利用纤维素酶和木瓜蛋白酶作用于香菇细胞壁，再加入β-葡聚酶，同时优化了多酶反应体系中的温度、时间以及加酶量；本发明在酶解过程中利用微波进行反应，由于能够微波引起细胞内部结构的变化，加速香菇多糖由外层细胞转移到酶解液中，加速了多糖酶解过程；再利用酿酒酵母进行发酵，在提高多糖产量的同时实现对β-葡聚
糖的纯化与富集，得到最优的酶解发酵协同转化香菇多糖的条件，可以明显提高多糖的提取率，缩短提取周期，同时制得的β-1，3葡聚糖抗氧化活性强、抑菌效果显著。
[0105]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。