一种慢病毒的纯化方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种慢病毒的纯化方法。


背景技术：

2.慢病毒(lentivirus)属于逆转录病毒科，是以人类免疫缺陷i型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，属于rna病毒。慢病毒的包装一般有三质粒和四质粒两种包装系统，目前常用的是四质粒包装系统，包括1个目的基因载体和3个辅助质粒，这四种质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清即为慢病毒。慢病毒主要用途有rnai表达研究、稳转细胞株筛选、基因治疗和药物研究等。
3.目前病原体核酸检测阳性质控品主要有核酸片段(dna或rna)和病毒颗粒质控品，通常是慢病毒、灭活病毒等。核酸片段质控品制备简单、成本低廉，但是不参与样本处理和检测的全过程，且容易被空气中的rnase降解，而慢病毒结构与真实病毒相似，不易被rnase降解，能够参与病原体核酸检测全过程并对其将进行有效监控，更加适合作为阳性质控品。然而在慢病毒包装过程中通常加入过量的目的基因载体转染细胞，导致收集到的病毒上清中有大量质粒残留，从而影响质控品的核酸拷贝数定量。
4.目前尚未有方法将慢病毒上清中残留质粒完全去除，因此开发慢病毒残留质粒去除的方法至关重要。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种慢病毒的纯化方法，该方法纯化效果好，操作步骤简单快速，成本低。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.一种慢病毒的纯化方法，包括：
8.将慢病毒稀释至10～1
×
105copies/μl，加入dnase i，孵育。
9.本发明中，所述慢病毒用depc水稀释，稀释后的浓度优选为1
×
104copies/μl。
10.本发明中，所述dnase i在加入前用depc h2o稀释，所述dnase i稀释后的浓度优选为10～50u/μl，具体可为10u/μl、20u/μl、30u/μl、40u/μl或50u/μl。
11.本发明中，所述孵育的体系为：
[0012][0013]
一些具体实施例中，所述孵育体系由如下组分配制而成：
[0014][0015]
本发明中，所述孵育的温度为37-42℃，具体可为37℃、38℃、39℃、40℃、或41℃；孵育时间为0.5-1.5h，具体可为0.5h、1h或1.5h。
[0016]
本发明所述的慢病毒的纯化方法，还包括对孵育产物进行质量检测的步骤。
[0017]
所述对孵育产物进行质量检测包括：
[0018]
取孵育产物加入edta，灭活dnase i，然后加入病毒裂解液裂解；
[0019]
将裂解产物分为裂解产物1和裂解产物2；
[0020]
利用qpcr检测裂解产物1中的残留质粒，得到ct1值；
[0021]
利用rt-qpcr检测裂解产物2中靶标核酸，得到ct2值；
[0022]
计算δct＝ct1-ct2；
[0023]
当所述δct≥10，判定所述孵育产物(即纯化后的慢病毒)质量合格。
[0024]
本发明中，所述病毒裂解液包括tris-hcl、bsa、tcep-hcl、tritonx-100、np-40和蛋白酶k，一些具体实施方案中，各组分浓度为：0～50mm tris-hcl(ph8.0)、1-10mm tcep-hcl、0.1～0.5％bsa、0.2％～0.5％tritonx-100、0.2％～0.5％np-40、5-40ug/ml蛋白酶k。
[0025]
本发明中，所述edta的加入量为至edta终浓度为1-10mm，具体可为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。
[0026]
本发明提供一种慢病毒的纯化方法，首先将慢病毒稀释至特定浓度，然后加入稀释后的dnase i，孵育，有效地去除了慢病毒上清的残留质粒，降低了残留质粒对慢病毒核酸拷贝数定量的影响，克服了慢病毒用作核酸检测质控品的一大障碍。相比传统方法，该方法具有去除残留质粒效果好、简单快速等优点，具有广泛地应用前景。
具体实施方式
[0027]
本发明提供了一种慢病毒的纯化方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0028]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0029]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0030]
实施例1丙型肝炎慢病毒残留质粒去除
[0031]
按照如下步骤对慢病毒残留质粒去除：
[0032]
1.慢病毒说明书中病毒滴度为10^5copies/μl，根据公式计算得出慢病毒核酸拷贝数为3*10^6copies/μl；
[0033]
2.使用depc h2o将慢病毒稀释至10^4copies/μl，以不稀释的慢病毒原液(3*10^
6copies/μl)作为对照；
[0034]
3.使用depc h2o稀释dnase i(50u/μl)至20u/μl；
[0035]
4.按照下表配制dnase i处理体系。
[0036]
表1
[0037]
组分加样量慢病毒(10^4copies/μl)5μldnasei10
×
buffer6.8μldnasei(20u/μl)3μldepch2o52.7μl
[0038]
加样完毕后震荡混匀，之后瞬时离心，37℃孵育40min；
[0039]
5.加入edta至体系终浓度为5mm，本实施例使用50mm edta，加入的量为7.5μl，之后震荡混匀并瞬时离心，65℃孵育10min；
[0040]
6.取上述步骤的处理产物2μl，加入8μl病毒裂解液，之后震荡混匀并瞬时离心，55℃孵育15min，75℃孵育10min；
[0041]
7.将裂解产物等分为两份，使用taqpro
tm
hs universal probe mastermix(诺唯赞，货号：qn113)在abi 7500荧光定量pcr仪上对一份中的残余质粒进行检测，以未处理的稀释后的慢病毒作为对照，反应体系如下表所示：
[0042]
表2
[0043][0044]
扩增反应程序如下表所示：
[0045]
表3
[0046][0047]
[0048]
8.使用hscript ii one step qrt-pcr probe kit(诺唯赞，货号：q222)在abi 7500荧光定量pcr仪上对另一份中的靶标核酸进行检测，反应体系如下表所示：
[0049]
表4
[0050][0051]
扩增反应程序如下表所示：
[0052]
表5
[0053][0054]
根据标准品质粒拷贝数与qpcr ct值的标准曲线计算出处理组与未处理组残留质粒拷贝数，再根据公式残留质粒量(ng/μl)＝拷贝数(copies/μl)*碱基数*660/6.02*10^14计算出残留质粒量。稀释后的慢病毒及未稀释的慢病毒质粒残留量如表6和表7所示，根据qpcr与rt-qpcr ct值差值δct评估质粒去除效果，稀释后的慢病毒(10^4copies/μl)质粒去除效果如表6所示，慢病毒原液(3*10^6copies/μl)的质粒去除效果如表7所示：
[0055]
表6
[0056][0057]
表7
[0058][0059]
由上述结果可知，经过本发明方法处理后残留质粒的量显著降低，由未处理的10^-2ng/μl(慢病毒原液)降低至处理后10^-6ng/μl(稀释后进行dnase i处理的慢病毒)，表明本方法可有效去除慢病毒中的残留质粒。慢病毒原液的δct＜10，本发明将慢病毒稀释后进行dnase i处理后质粒残留符合要求(δct≥10)，说明本发明提供的纯化方法能够有效去除残留质粒，可进行后续拷贝数定量。
[0060]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。