一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法。


背景技术：

2.贴壁动物细胞广泛用于包括疫苗、蛋白药物等生物制品的制备过程，常见的有vero、mdck、mrc-5、wi-38、cho和293细胞等，而细胞冻存是细胞保存的常见方法之一。
3.对于贴壁生长的动物细胞而言，通常借助微载体和培养容器进行大规模培养。微载体提供细胞贴附的大量表面，细胞贴附在微载体表面生长扩增，微载体在培养容器中悬浮运动，培养容器提供细胞生长所需的营养成份和适宜环境，因此极大提高了生产效率和可控性。
4.若保存时，通常需从微载体上收获并制备单细胞悬液，再对单细胞悬液进行冻存，不仅操作繁杂且易造成细胞量损失；同时会破坏细胞与微载体的黏附关系而造成存活率降低。申请号201810556039.x的中国专利公开了一种动物细胞低温冷藏保存和运输的方法，包括：(1)细胞培养容器中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到容器中培养；(2)细胞生长达到对数生长期后，用细胞活性保存液将培养基置换出来。(3)将附着在多孔微载体的细胞悬浮在细胞活性保存液中，转移到保存容器中，装液量要达到90％左右；(4)放入4-8℃冷藏保存或运输。上述方法能避免反复冻融对细胞损害，但需定期更换特殊配方的保存液，保存细胞数量少，操作繁琐。
5.因此，有必要研发一种新的贴壁动物细胞保存方法。


技术实现要素：

6.本发明解决的问题是如何稳定的实现动物细胞的规模化保存。
7.本发明提供一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，包括：(1)反应器中加入微载体和培养液，将细胞悬液按接种密度接种到反应器中培养，所述微载体呈实心无孔型；(2)待细胞满微载体时进行固液分离，得到微载体细胞；(3)加入预冷的培养液后进行混合重悬，放入0-8℃下冷藏保存或运输。
8.优选的，步骤(1)中代培养的细胞数量与所述微载体重量比为4
×
106～9
×
107个/g。
9.优选的，所述微载体的直径为25～750μm，密度为1.01～1.20g/ml。
10.优选的，步骤(1)所述细胞悬液为vero细胞、mdck细胞、mrc-5细胞、wi-38细胞、cho细胞和293细胞中的任意一种，上述细胞均为表面依附性生长的贴壁细胞。
11.优选的，所述细胞悬液依次经细胞复苏、方瓶培养、转瓶培养获得。优选的，所述细胞悬液采用下述方式进行培养：a)细胞复苏从细胞种子库中取一支或多支细胞冻存管，解冻后在方瓶内进行细胞复苏，8～24时更换培养液；培养温度35℃～38℃，培养箱co2浓度3％～7％，细胞生长至致密单层后进行消化传代；b)方瓶培养上述细胞在细胞方瓶中培养，
细胞贴附在方瓶内壁上生长，并传代2～4代；细胞传代比例为1：3～1：6，培养温度35℃～38℃，培养箱co2浓度3％～7％，细胞生长至致密单层后进行消化传代；c)转瓶培养将上述方瓶中的细胞接种入转瓶，细胞贴附在转瓶内壁上生长，并进行培养传代2～4代；传代比例1：5～1：6比例，培养温度35℃～38℃，转瓶机转速7～13rpm，细胞生长至致密单层后进行消化传代。所述“细胞传代比例”指“供细胞生长的面积”，1：3表示1个方瓶细胞可传出3个同样的方瓶细胞。
12.优选的，步骤(2)中通过离心或静置的方式进行固液分离，离心转速为500～1000rpm，1～5min，静置时确保悬液液面不高于30cm时，自然沉降10min以上。
13.优选的，步骤(3)中所述培养液为199或dmem或mem培养液，并在所述培养液中加入1％～12％牛血清或0.1～0.5％人血白蛋白。上述操作均为无菌操作，所用溶液和样品以密闭方式保存，防止被外源微生物污染。
14.步骤(3)中保存微载体细胞的容器材质可以是玻璃、不锈钢、pp或其他高分子材料，可耐压力且能经受蒸汽高压灭菌或辐照灭菌。优选的，步骤(3)中混合重悬后，以10-20rpm离心3-5min，弃取上清使微载体细胞与营养液的质量体积比为1g:0.5-0.8ml。混合后的微载体细胞由于密度过大而自然沉降，申请人研究发现：沉降对细胞生长无影响，对其进行轻微离心后能够缩小体积，有利于保存、运输。
15.优选的，所述培养液的温度为0-8℃。优选的，所述培养液的温度为保存或运输温度+5℃，该设置可分段进行降温，避免温度下降过快使细胞产生应激反应。优选的，所述培养液与微载体细胞混合后按照0.2-0.5℃/min进行降至设定温度。
16.优选的，步骤(3)中保存或运输温度为0-8℃；在不结冰的前提下，温度越低越好，防止产生冰晶对细胞造成损伤。
17.相对于现有技术，本发明所述的贴壁动物细胞的规模化低温保存方法具有下述有益效果：不需要额外的冻存剂即可实现动物细胞的规模化保存或运输；保存体积小，操作简单可靠，便于实施。
附图说明
18.图1为本发明实施例1中微载体细胞在低温存放过程中的细胞图片；
19.图2为本发明实施例1中微载体细胞在低温存放中的细胞活性数据；
20.图3为本发明实施例1中微载体细胞经低温存放后在t75方瓶的生长情况；
21.图4为本发明实施例2中微载体细胞在低温存放过程中的细胞图片；
22.图5为本发明实施例2中微载体细胞在低温存放中的细胞活性数据；
23.图6为本发明实施例2中存放的微载体细胞接种病毒后的微载体细胞图(moi0.025)
24.图7为本发明实施例2存放的微载体细胞在接种病毒后的微载体细胞图(moi0.005)
25.图8为本发明实施例2存放的微载体细胞在接种病毒后的微载体细胞图(moi0.001)
26.图9为本发明实施例3中微载体细胞在低温存放过程中的细胞图片；
27.图10为本发明实施例3中微载体细胞在低温存放中的细胞活性数据
28.图11为本发明实施例3中微载体细胞经低温存放后在t75方瓶的生长情况。
具体实施方式
29.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
30.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。相关的开口操作均是在生物安全柜或层流保护下，或采用无菌管道连接技术进行的无菌操作。所述微载体(cytodex 1)是美国思拓凡公司的产品，产品目录号(货号)为17-0448-04；胰蛋白酶是美国gibco公司的产品，货号为27250-018；199培养基是美国gibco公司的产品，货号03-5008ej。
31.目前常见的细胞传代存在下述不足：1)在细胞扩增传代后期，如第n代，由于细胞数量较多(最大量不低于900亿个细胞)，通常无法将细胞全部或大量保存，只能采用更大培养容器(放大后)连续进行后续培养，或者废弃，或者只能选择极少部分(一般不超过2亿细胞)进行液氮冻存，且冻存会损伤部分细胞；2)通常用方瓶或多级方瓶以培养温度或常温运输，运输细胞量少且运输时限很短；若用液氮超低温系统运输细胞冻存管，则运输细胞数量更少，代价大。对于动物细胞而言，上述方法均不适用规模化的保存或运输。为此申请人提出如下技术方案：
32.实施例1
33.采用细胞培养用2l玻璃旋转瓶，培养液体积1l，微载体(思拓凡公司cytodex1)浓度3g/l，接入2亿个vero细胞，置于培养箱中37℃培养4天，每天更换新鲜培养液，ph7.0～7.4、do20％～70％借助磁力搅拌器搅拌控制速度在30～60rpm。
34.所述vero细胞采用如下方式获得：
35.a)细胞复苏从细胞种子库中取一支或多支细胞冻存管，解冻后在方瓶内进行细胞复苏，8～24时更换培养液；培养温度35℃～38℃，培养箱co2浓度3％～7％，细胞生长至致密单层后进行消化传代。
36.b)方瓶培养上述细胞在细胞方瓶中培养，细胞贴附在方瓶内壁上生长，并传代2～4代；细胞传代比例为1：3～1：6，培养温度35℃～38℃，培养箱co2浓度3％～7％，细胞生长至致密单层后进行消化传代。
37.c)转瓶培养将上述方瓶中的细胞接种入转瓶，细胞贴附在转瓶内壁上生长，并进行培养传代2～4代；传代比例1：5～1：6比例，培养温度35℃～38℃，转瓶机转速7～13rpm，细胞生长至致密单层后进行消化传代。
38.待细胞基本贴满微载体时(如图1-第0天)，停止旋转瓶培养，将旋转瓶中培养液转入2个1l离心杯中，密封后进行离心，500rpm，离心2min。移除上清，每个离心杯中加入5℃的约50ml新鲜的199培养液，轻微摇晃混匀后，将2个离心杯细胞悬液合并在一起，混匀后，平分至5支50ml无菌离心管中，低速离心且以0.4℃/min的速率降温至4℃，保存备用。
39.在第0、7、14天取样计算细胞活性。细胞活性定义为总细胞中的活细胞数比例，即细胞活性＝活细胞数/(活细胞和死细胞数目总和)x100％。微载体细胞在第0天，第7天和第14天的细胞活性分别为100％，99％和99％，基本无变化，结果见图2。
40.第14天，取出上述保存的1支离心管，将其中的微载体细胞转入到1支500ml旋转瓶
中进行平衡，用pbs溶液置换原来的培养液后，加入胰蛋白酶消化细胞，获得细胞悬液，取部分细胞接入t75方瓶进行培养，观察细胞生长状态，并拍照记录细胞形态照片，结果见图3；细胞处于扩增阶段，其生长状态正常。
41.实施例2
42.采用30l不锈钢反应器(购自赛多利斯公司，型号：c-30)中，培养液体积30l，微载体(思拓凡公司cytodex1)量300g，接入180亿vero细胞(购自美国标准菌种保藏中心，ccl-81，本司建有细胞种子库)，37℃搅拌培养，转速为35～55rpm，ph7.1～7.4，do20％～60％，培养4天，采取灌流不间断方式更换新鲜培养液。
43.待细胞基本贴满微载体时(如图4-第0天)停止培养，此时细胞数量可达1800亿以上，静置30min进行自然沉降，移除上清后加入4℃新鲜的199培养液至30l液位，混匀后，以15rpm离心5min，弃取上清使微载体细胞与营养液的质量体积比为1g:0.6ml,转出至1个50l容器(不锈钢或pp材质均可)中，密闭，以0.2℃/min速率降温至4℃保存备用。
44.在第0、7、14天取样计算细胞活性。细胞活性定义为总细胞中的活细胞数比例，即细胞活性＝活细胞数/(活细胞和死细胞数目总和)x100％。微载体细胞在第0天，第7天和第14天的细胞活性分别为100％，97％和100％，基本无变化，结果见图5。
45.从50l容器中保存的微载体细胞悬液分成三份，依次接入30l培养容器中，微载体(思拓凡公司cytodex1)量160-170g，34℃搅拌培养，转速为35～55rpm，ph7.3～7.4，do20％～60％，培养1天后，分别按照moi0.025、moi0.005、moi0.001接种ev71毒种，进行病变相关研究，结果见图6、图7、图8。
46.根据上述实验过程，参数控制在moi0.005时，显示病变时间适中，对应的细胞碎片释放速度适中，利于过程控制和获得目标病毒。初步确定moi0.005为合适参数，在此基础上，可继续进行相关研究。由此看出，若一次性培养较多细胞，低温保存后，分批进行后续实验，将会明显提高工作效率。
47.实施例3
48.采用5l玻璃罐反应器(购自赛多利斯公司，型号：b-5)进行培养，培养体积5l，微载体(思拓凡公司cytodex1)量60g，接入30亿vero细胞(购自美国标准菌种保藏中心，ccl-81，本公司建有细胞种子库)，37℃培养，反应器搅拌速度60～80rpm，ph 7.0～7.4，do 20％～60％，培养4天，采取不间断灌流方式更换新鲜培养液。
49.待细胞基本贴满微载体时(如图9-第0天)停止培养，此时细胞可达到300亿以上，静置20min进行自然沉降，移除上清并加入新鲜的199培养液至9l液位，混匀后以20rpm离心4min，弃取上清使微载体细胞与营养液的质量体积比为1g:0.8ml,转出至1个10l瓶(不锈钢或pp材质)中，密闭，2～8℃保存。随后，2～8℃运输到其他地方进行后续实验研究。
50.微载体细胞在第0天，第7天和第14天的细胞活性分别为100％，97％和97％，基本无变化，结果见图10；在14天时，从低温保存细胞的容器中，取样消化后制备细胞悬液，接种于方瓶中进行培养，观察细胞生长情况，结果见图11。培养过程中细胞生长情况正常，说明经过运输，且经过低温保存14天的细胞可继续进行传代生长。
51.虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。