一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与流程

1.本发明属于可再生能源和生物质能源以及化工原料生产技术领域，具体涉及一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法。


背景技术：

2.人类活动造成大气二氧化碳(co2)浓度不断升高，使当今世界面临着气候变化的重大危机。微生物co2固定为实现地球“碳中和”提供了一条有前景的绿色发展路线。另一方面，由于化石能源面临枯竭，而co2是一种潜在的碳资源，对co2的利用也是一种发展可持续型社会的方法。与自养微生物相比，异养微生物具有更快的生长速度和更先进的遗传工具，但是其固定co2的能力还很有限。近年来，基于合成生物学技术强化异养微生物co2固定受到诸多关注，主要包括优化能量供给、改造羧化途径以及基于异养微生物间接固定co2。
3.公开号为cn103316583a的专利提供了一种利用水华藻固定co2的方法，将密闭半密闭环境中含有co2的气体通入水华藻溶液中，加入一定量的钙离子溶液，利用水华藻的生物钙化作用，促进水体中的ca
2+
和co
32-结合生成caco3沉淀，从而固定气体中的co2。但是该方法中部分co2将会被水华藻吸收，转换为无法利用的水华藻生物质，且产物经济价值低。公开号为cn103881905a专利提供了一种嵌入式生物电合成系统，通过外加电势，把废弃物、废水厌氧氧化与生物还原合成进行偶联，厌氧氧化反应器内的废弃物、废水厌氧氧化产生的电子传递到作为导电器壁的阴极后，电子流通过器壁向电合成反应器内的微生物菌群传递，微生物菌群获得电子后，将co2还原合成有机化学品。该方法利用微生物反应器仅需少量电能便能有效固定co2，但是由于其只适用于厌氧环境下高浓度co2的固定，且产物为多种气态液态有机物的混合物，因此实用性受到限。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，该方法能够实现对二氧化碳混合气体直接固定处理，通过微生物发酵转化生成有机质，其产物总碳浓度明显增加，且进一步提升有机酸和醇酯化反应的酯转化率，产物附加值明显提高。
5.本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
6.一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，其中所述微生物固定二氧化碳通过利用微生物发酵过程，碳化合物不完全氧化产生有机酸和/或醇化合物；和/或，
7.在固定化酶作为催化剂条件下有机酸与有机醇通过酯化反应生成酯基化合物；
8.上述固定化酶用固定化载体材料包括壳聚糖微球或表面修饰壳聚糖微球；其中，表面修饰壳聚糖微球的活性官能团至少包括羟基、氨基、羧基、环氧基。本发明利用微生物发酵过程通过混养发酵，完成对二氧化碳的固定，并且通过微生物生命活动转化生成有机质，如有机酸和/或醇，实现高效、安全的二氧化碳处理，并且不需对二氧化碳混合气体进行分离，简化了二氧化碳固定或转换工艺，同时获得高附加值的产品，实现资源化再利用。本
发明还提供了将固定二氧化碳产生的有机酸和醇进行酯化反应获得酯基类化合物的方法，并且该反应是在二氧化碳加压条件下进行的，在保证反应体系适宜的ph环境条件下，加入固定化酶作为催化剂，进行高效的酯化反应，获得酯基类化合物产品。本发明通过化学反应手段对固定化载体材料壳聚糖微球表面进行功能化修饰，引入更多的活性官能团，显著增强了固定化载体材料固载生物酶的能力，载酶量明显增强，获得的固定化酶的酶活力也显著增强，能够更好地催化酯化反应的发生，酯转化明显增加；且制得的固定化酶具有更优的使用稳定性。其原因可能在于，表面修饰后的壳聚糖微球引入更多活性官能团，如羧基、环氧基等，在固定生物酶过程中，能够增加载体表面的活性位点，更多量的固载生物酶，生物活性得到明显提升；同时可以与生物酶之间形成更牢固的作用力，在使用过程中对生物酶起到更佳的保护作用，使得得到的固化酶具有更优的使用稳定性。
9.具体而言，微生物包括产酸微生物菌株和/或产醇微生物菌株。
10.具体而言，产酸微生物菌株包括酪丁酸梭菌(clostridium tyrobutyricum)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)中的一种或多种。
11.具体而言，产醇微生物菌株包括拜氏梭菌(clostridium beijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中的一种或多种。
12.进一步的，一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，上述微生物固定二氧化碳通过利用微生物发酵过程，碳化合物不完全氧化产生有机酸和/或醇化合物；其中微生物包括食气梭菌c.carboxidivorans p7。
13.优选地，微生物菌株发酵过程中，在发酵培养基中加入表面活性剂，添加量为0.05～0.15％。
14.具体而言，表面活性包括皂素、吐温-80中的一种。
15.更优选地，表面活性还包括新型表面活性剂，其制备方法如下：
16.取腰果酚与1,3-二溴-2,2-二甲氧基丙烷进行醚化反应得到醚化产物；
17.取醚化产物进行磺化处理再经中和反应制得新型表面活性剂。本发明提供了一种新型结构的表明活性剂及其制备方法，制得的新型表面活性剂具有更优的表面活性，其表面张力相比于现有技术具有明显的降低；将其添加至微生物发酵培养基中，对微生物菌株产生有益的分散作用，有效延长结团现象出现的时间，促进微生物菌株代谢活动，提升菌株的产碳化合物能力，产物中总碳浓度明显增加。
18.具体的，上述新型表面活性剂的制备方法，包括：
19.取腰果酚，加入四乙基溴化铵、18～20％质量浓度的氢氧化钠水溶液，70～80℃下搅拌均匀，加入1,3-二溴-2,2-二甲氧基丙烷，95～105℃下反应3～5h，之后降至室温，乙醚萃取2～3次，2～4wt％醋酸洗涤有机层，再用水洗涤至中性，最后加入无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸馏得到醚化产物；
20.取醚化产物加入二氯甲烷溶解，冰水浴条件下缓慢加入含有0.18～0.24g/ml氯磺酸的二氯甲烷溶液，反应5～8h；之后加入1～1.5wt％的氢氧化钠-乙醇溶液中和，过滤得滤液，减压蒸馏、丙酮洗涤、过滤、烘干得到新型表面活性剂。
21.具体而言，四乙基溴化铵的加入量为腰果酚的6～7wt％；腰果酚与氢氧化钠水溶液的质量比为0.2～0.4g：1ml；1,3-二溴-2,2-二甲氧基丙烷与腰果酚的摩尔比为0.45～
0.5：1。
22.具体而言，醚化产物与二氯甲烷的固液比为0.3～0.4g：1ml；氯磺酸与醚化产物的摩尔比为2.4～2.6：1。
23.需要说明的是，有机酸、有机醇的酯化反应情况包括：
24.1)产酸微生物菌株发酵产生有机酸后添加有机醇进行酯化反应；或，
25.2)产醇微生物菌株发酵产生有机醇后添加有机酸进行酯化反应；或，
26.3)同时培养产酸微生物和产醇微生物，分别得到有机酸和有机醇进行酯化反应；或，
27.4)产酸和醇微生物菌株发酵产生有机酸及醇进行酯化反应。
28.需要说明的是，微生物固定二氧化碳过程中涉及的微生物菌株的操作，如活化培养、发酵等，均为本领域常规操作，属于本领域技术人员可理解范畴。
29.具体而言，表面修饰壳聚糖微球由杂氧酸酐化学接枝壳聚糖微球获得。
30.本发明又提供了上述固定化载体的制备方法，包括：
[0031]-制备壳聚糖微球；
[0032]-采用杂氧酸酐对壳聚糖微球表面进行化学修饰，得到固定化载体。
[0033]
进一步的，上述固定化载体的制备方法，具体包括：
[0034]
取壳聚糖溶于1～2wt％浓度的冰醋酸中，得到2～3wt％浓度的壳聚糖溶液，搅拌溶解后静置过夜，脱气泡，逐滴加入至等体积量的浓度为1.5～2.5m的氢氧化钠溶液中，室温下凝结1.5～3h，用去离子水反复洗涤至中性，得到壳聚糖微球；
[0035]
取壳聚糖微球，加入浓度为0.04～0.06g/ml的杂氧酸酐-乙醇溶液，60～65℃下搅拌反应10～12h；减压抽滤、乙醇浸泡8～10h，过滤、乙醇洗涤4～6次，60℃真空干燥24h得到固定化载体。
[0036]
具体而言，杂氧酸酐与壳聚糖微球的质量比为1：2～3。
[0037]
具体而言，固定化酶中生物酶包括脂肪酶。
[0038]
进一步的，上述固定化酶的制备方法，包括：
[0039]
固定化载体活化，取固定化载体加入0.1～0.15m浓度的mes缓冲液(ph＝5.5～6.5)中，18～24min后取出，加入edc/nhs混合液(n/n，1：0.9～1.1)中，室温下震荡活化20～40min，依次采用mes缓冲液、超纯水洗涤2～4次得到活性后的固定化载体；
[0040]
取活化后的固定化载体加入0.04～0.06m浓度的磷酸缓冲液(ph＝7～8)配制的脂肪酶液中，40～45℃水浴震荡条件下固定3～5h，之后用去离子水冲洗2～5次，过滤、干燥得到固定化酶。
[0041]
具体而言，固定化载体与mes缓冲液的固液比为1g：6～9ml；edc/nhs混合液与mes缓冲液的体积比为1.2～1.5：1；edc与固定化载体的质量比为0.35～0.5：1。
[0042]
具体而言，固定化载体与脂肪酶液的固液比为1g：8～12ml；脂肪酶液的浓度为2.5～4mg/ml。
[0043]
具体而言，固定化酶的载酶量＞30mg/g载体；固定化酶的酶活性＞1600u/g。
[0044]
具体而言，微生物固定二氧化碳过程用二氧化碳或含其的混合气体压力为0.05～4mpa。
[0045]
具体而言，微生物固定二氧化碳温度为15～40℃。
[0046]
具体而言，酯化反应的温度为45～55℃；反应时间为2～4h。
[0047]
本发明的又一目的在于，提供了上述表面修饰壳聚糖微球作为载体材料的应用。
[0048]
本发明的又一目的在于，提供了杂氧酸酐在增强权利要求1中所述的表面修饰壳聚糖微球固酶能力中的用途。
[0049]
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0050]
本发明利用微生物发酵过程通过混养发酵，完成对二氧化碳的固定，并且通过微生物生命活动转化生成有机质，实现高效、安全的二氧化碳处理，获得高附加值的产品，经济效益更高。本发明还提供了将固定二氧化碳产生的有机酸和醇进行酯化反应获得酯基类化合物的方法，采用杂氧酸酐对固定化载体材料壳聚糖微球表面进行功能化修饰，显著增强了固定化载体材料固载生物酶的能力，获得的固定化酶的酶活力也显著增强，能够更好地催化酯化反应的发生，酯转化明显增加；且制得的固定化酶具有更优的使用稳定性。同时，本发明制备得到一种新型表面活性剂，具有更优的表面活性，将其添加至微生物发酵培养基中，对微生物菌株产生有益的分散作用，有效延长结团现象出现的时间，促进微生物菌株代谢活动，，产物中总碳浓度明显增加。
[0051]
因此，本发明提供了一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，该方法能够实现对二氧化碳混合气体直接固定处理，通过微生物发酵转化生成有机质，其产物总碳浓度明显增加，且进一步提升有机酸和醇酯化反应的酯转化率，产物附加值明显提高。
附图说明
[0052]
图1为本发明实施例3中制备的新型表面活性剂的红外光谱；
[0053]
图2为本发明实施例5中制备的表面修饰壳聚糖微球及壳聚糖微球的红外光谱；
[0054]
图3为本发明试验例3中固定化酶酶活力及载酶量测试结果；
[0055]
图4为本发明试验例4中表面活性剂分散微生物菌株效果图。
具体实施方式
[0056]
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细描述：
[0057]
本发明实施例所用食气梭菌c.carboxidivorans p7购自德国微生物菌种保藏中心，dsm-15243t。
[0058]
本发明实施例所用酪丁酸梭菌市购，保藏号：atcc 25755。
[0059]
本发明实施例所用酿酒酵母市购，保藏号：atcc 9763。
[0060]
本发明实施例所用微生物菌株均经过活化处理，其活化操作按照本领域现有技术公开的常规处理方法进行即可。
[0061]
实施例1：
[0062]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，如下：
[0063]
厌氧发酵罐中加入发酵培养基1754(含2.0g/l葡萄糖)，然后接种7.6％食气梭菌c.carboxidivorans p7的二级培养液(od
600
为1.2)，之后充入合成气(co：co2：h2：ar＝36：40：8：16)，其中充气用装置内部压力设置为0.2mpa，过程持续2min；置于37℃、100rmp条件下培养发酵96h，发酵过程中每24h更新一次合成气。发酵产物中总产物浓度为(123.28
±
10.83)mm。
[0064]
发酵产物测定：
[0065]
前处理，取发酵样品离心(12000rpm，10min)得到上清液，取0.2ml加入内标液(异丁醇2.0g/l+异丁酸2.0g/l)0.05ml，混合均匀后离心(12000rpm，5min)得到上清液，取0.2ml进样检测。
[0066]
测试采用气相色谱进行，色谱柱为毛细色谱柱(alltech ec-wax 30m
×
0.32mm，alltech associates inc.，deerfield.illinois.usa)；分析条件包括：柱温，起始85℃，50℃/min速率升温至150℃，恒温2.5min，接着以100℃/min速率升温至200℃，恒温1.5min；氢气流量30ml/min、空气流量400ml/min；进样区温度250℃，氢火焰检测区温度为300℃；检测器为火焰离子检测器：进样量1μl，分流比为25：1。
[0067]
标定方法采用内标法，标准样品为：乙醇6.0g/l+丁醇2.0g/l+异丁醇2.0g/l+己醇1.0g/l+乙酸6.0g/l+丁酸1.0g/l+异丁酸2.0g/l+己酸1.0g/l。
[0068]
总产物浓度(产物包含的总碳浓度，mmol/l)计算公式：
[0069]
c＝1000(2c
乙醇
/46.07+2c
丁醇
/60.05+4c
己醇
/74.12+4c
乙酸
/88.11+6c
丁酸
/102.18+6c
己酸
/116.16)。
[0070]
实施例2：
[0071]
使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与实施例1不同：
[0072]
厌氧发酵罐中加入发酵培养基1754(含2.0g/l葡萄糖+0.11wt％表面活性剂皂素)，然后接种6.2％食气梭菌c.carboxidivorans p7的二级培养液(od
600
为0.8-1.5)，之后充入合成气(co：co2：h2：ar＝36：40：8：16)，其中充气用装置内部压力设置为0.2mpa，过程持续2min；置于37℃、100rmp条件下培养发酵84h，发酵过程中每24h更新一次合成气。发酵产物中总产物浓度为(134.05
±
9.47)mm。
[0073]
实施例3：
[0074]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与实施例2的不同：
[0075]
采用本实施例制备的新型表面活性剂替代表面活性剂皂素。得到的发酵产物中总产物浓度为(168.19
±
11.03)mm。
[0076]
上述新型表面活性剂的制备：
[0077]
取腰果酚，加入四乙基溴化铵(加入量为腰果酚的6.4wt％)、20％质量浓度的氢氧化钠水溶液，其中腰果酚与氢氧化钠水溶液的用量比为0.31g：1ml；78℃下搅拌均匀，加入1,3-二溴-2,2-二甲氧基丙烷(与腰果酚的摩尔比为0.48：1)，100℃下反应4h，之后降至室温，乙醚萃取3次，3wt％醋酸洗涤有机层，再用水洗涤至中性，最后加入无水硫酸镁干燥、过滤、减压蒸馏得到醚化产物；
[0078]
按照固液比为0.36g：1ml的比例取醚化产物加入二氯甲烷溶解，冰水浴条件下缓慢加入含有0.22g/ml氯磺酸(与醚化产物的摩尔比为2.5：1)的二氯甲烷溶液，反应6h；之后加入1.2wt％的氢氧化钠-乙醇溶液中和，过滤得滤液，减压蒸馏、丙酮洗涤、过滤、烘干得到新型表面活性剂。
[0079]
实施例4：
[0080]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与实施例3的不同：
[0081]
在发酵培养基中加入1.5g/l2,3-二硫代(2-巯基)-1-丙烷硫醇。得到的发酵产物中总产物浓度为(195.63
±
8.76)mm。本发明在微生物菌株发酵培养基中加入2,3-二硫代
(2-巯基)-1-丙烷硫醇，其可以作为碳源、硫源物质，能够更好地促进微生物菌株的代谢活动，进一步增加发酵产物中总碳产物浓度。
[0082]
新型表面活性剂的制备与实施例3相同。
[0083]
实施例5：
[0084]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，如下：
[0085]
厌氧发酵罐中加入100ml发酵培养基(含20g/l浓度葡萄糖，6.7g/l蛋白胨，6.7g/l牛肉膏，2g/l酵母膏，3.3g/lnacl，2g/l醋酸钠，0.3g/l半胱氨酸盐酸盐)，然后接种6.8％酪丁酸梭菌的二级培养液(od
600
为1.3)，之后充入co2气体，其中充气用装置内部压力设置为1mpa，过程持续1.5min；置于37℃、100rmp条件下培养发酵48h，发酵过程中每24h更新一次合成气。发酵产物中丁酸浓度为4.2g/l(测试方法同实施例1)，ph为5.8。
[0086]
酯化反应，取5ml发酵液加入等体积量的提取溶剂十四烷混合置于高压反应器中，再加入与丁酸等摩尔量的丁醇，然后加入固定化酶(加入量为底物量的4.6wt％)，通入二氧化碳获得3.5mpa压力，48℃条件下反应3h，分离培养基和提取溶剂，对实验前后培养基和提取溶剂中的丁酸和丁酸丁酯浓度进行分析(采用gc-fid)，并按照下列式子计算酯转化率：
[0087]
酯转化率/％＝萃取溶剂中丁酸丁酯的摩尔数/萃取前丁酸的摩尔数
×
100％
[0088]
上述固定化酶的制备：
[0089]
固定化载体活化，按照固液比为1g：7.5ml的比例取固定化载体加入0.12m浓度的mes缓冲液(ph＝6.0)中，22min后取出，加入edc/nhs混合液(n/n，1：1)中，其中edc/nhs混合液与mes缓冲液的体积比为1.36：1，edc与固定化载体的质量比为0.44：1；室温下震荡活化35min，依次采用mes缓冲液、超纯水洗涤4次得到活性后的固定化载体；
[0090]
按照固液比为1g：10ml的比例取活化后的固定化载体加入0.05m浓度的磷酸缓冲液(ph＝7.3)配制的脂肪酶液(浓度为3.2mg/ml)中，42℃水浴震荡条件下固定4h，之后用去离子水冲洗4次，过滤、干燥得到固定化酶。
[0091]
上述固定化载体的制备：
[0092]
取壳聚糖溶于1.5wt％浓度的冰醋酸中，得到2.5wt％浓度的壳聚糖溶液，搅拌溶解后静置过夜，脱气泡，逐滴加入至等体积量的浓度为2m的氢氧化钠溶液中，室温下凝结2h，用去离子水反复洗涤至中性，得到壳聚糖微球；
[0093]
取壳聚糖微球，加入浓度为0.05g/ml的杂氧酸酐-乙醇溶液，其中杂氧酸酐与壳聚糖微球的质量比为1：2.4；65℃下搅拌反应12h；减压抽滤、乙醇浸泡10h，过滤、乙醇洗涤6次，60℃真空干燥24h得到固定化载体。
[0094]
实施例6：
[0095]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与实施例5的不同：
[0096]
酯化反应过程中所用固定化酶为本实施例制备的，固定化酶加入量为底物量的5.4wt％。
[0097]
固定化酶的制备与实施例5的不同：
[0098]
固定化载体的制备：杂氧酸酐与壳聚糖微球的质量比为1：3；
[0099]
固定化载体与脂肪酶液的固液比为1g：9ml；脂肪酶液的浓度为3.8mg/ml。
[0100]
实施例7：
[0101]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与实施例5的不同：
[0102]
酯化反应过程中所用固定化酶为本实施例制备的；固定化酶加入量为底物量的4.0wt％。
[0103]
固定化酶的制备与实施例5的不同：
[0104]
固定化载体的制备：杂氧酸酐与壳聚糖微球的质量比为1：2.2；
[0105]
固定化载体与脂肪酶液的固液比为1g：12ml；脂肪酶液的浓度为2.8mg/ml。
[0106]
实施例8：
[0107]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法与实施例5的不同：
[0108]
酯化反应过程中所用固定化酶为本实施例制备的。
[0109]
固定化酶的制备与实施例5的不同：
[0110]
固定化载体制备过程中采用丁二酸酐替代杂氧酸酐。
[0111]
实施例9：
[0112]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，如下：
[0113]
厌氧发酵罐中加入100ml发酵培养基sc(含20g/l浓度葡萄糖糖)，然后接种5％酿酒酵母的二级培养液(od
600
为1.0)，之后充入co2气体，其中充气用装置内部压力设置为0.5mpa，过程持续2min；置于40℃、100rmp条件下培养发酵84h，发酵过程中每24h更新一次合成气。发酵产物中乙醇浓度为6.34g/l(测试方法同实施例1)，ph为5.8。
[0114]
酯化反应，取5ml发酵液中加入等体积量的提取溶剂十四烷混合置于高压反应器中，加入与乙醇等摩尔量的乙酸，然后加入固定化酶(实施例5制备的)，通入二氧化碳获得3mpa压力，45℃条件下反应3.5h，分离培养基和提取溶剂，对实验前后培养基和提取溶剂中的乙醇和乙酸乙酯浓度进行分析(采用gc-fid)，并计算酯转化率。
[0115]
实施例10：
[0116]
一种使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法，如下：
[0117]
微生物菌株发酵产生丁酸的过程同实施例5得到含酸发酵产物；
[0118]
微生物菌株发酵产生乙醇的过程同实施例9得到含醇发酵产物；
[0119]
酯化反应，取5ml含酸发酵产物加入含醇发酵产物(其中丁酸与乙醇摩尔比为1:1)，再加入等体积量的提取溶剂十四烷混合，置于高压反应器中，然后加入固定化酶(实施例5制备的)，通入二氧化碳获得3.5mpa压力，50℃条件下反应3h，分离培养基和提取溶剂，对实验前后培养基和提取溶剂中的丁酸和丁酸乙酯浓度进行分析(采用gc-fid)，并计算酯转化率。
[0120]
试验例1：
[0121]
红外表征
[0122]
油状液体样品用玻璃棒蘸取少量滴在玻璃片上，再盖上一块儿玻璃，进行红外光谱测定；固体样品采用溴化钾压片法进行测定。测定波长范围4000～500cm-1
。
[0123]
对实施例5制备的醚化产物进行上述测试，得到红外光谱图，分析可知：3000～2800cm-1
范围内出现甲基、亚甲基特征吸收峰；1600～1400cm-1
范围内出现苯环骨架振动特征吸收峰；1140cm-1
附近出现c-o-c键的特征吸收峰；879cm-1
、751cm-1
、687cm-1
附近出现苯环的c-h键对称弯曲振动；以上结果表明醚化产物成功制备。
[0124]
对实施例5制备的新型表面活性剂进行上述测试，结果如图1所示。从图中分析可知，3000～2800cm-1
范围内出现甲基、亚甲基特征吸收峰；1600～1400cm-1
范围内出现苯环
骨架振动特征吸收峰；1109cm-1
附近出现s＝o键的特征吸收峰；结果表明新型表面活性剂成功制备。
[0125]
对壳聚糖微球以及实施例5制备的表面修饰壳聚糖微球进行上述测试，结果如图2所示。从图中分析可知，相比于壳聚糖微球的红外测试结果，在实施例5制备的表面修饰壳聚糖微球红外图谱中，1688cm-1
附近出现c＝c键的特征吸收峰；1657cm-1
、1562cm-1
附近出现酰胺基团的特征吸收峰；以上结果表明实施例5中表面修饰壳聚糖微球成功制备。
[0126]
试验例2：
[0127]
酯转化率测试结果
[0128]
实施例5-实施例10提供的使用微生物固定二氧化碳生成有机物产品的方法中，酯化反应过程的酯转化率测试结果如表1所示：
[0129]
表1酯转化率测试结果
[0130][0131][0132]
从表1中数据分析可知，本发明实施例5提供的方法中酯转化率明显高于实施例8提供的方法，表明采用杂氧酸酐对壳聚糖微球表面进行修饰后，得到固定化材料用于固定化酶工艺中，具有更优的催化活性，显著提高酯化反应程度，酯转化率明显增加。
[0133]
试验例3：
[0134]
脂肪酶活力测定
[0135]
测试采用经典的橄榄油乳化法进行，其活力单位定义为：40℃、ph7.5条件下，每克脂肪酶或固定化脂肪酶每分钟水解橄榄油生成脂肪酸的微摩尔数，单位u/g或u/g载体。反应过程中生成的脂肪酸含量用标准氢氧化钠溶液进行滴定。
[0136]
载酶量测定
[0137]
测试采用考马斯亮蓝法进行。具体操作包括：
[0138]
标准蛋白溶液配制，取10mgbas溶于0.15m浓度的氯化钠溶液中，定容至100ml，配制得到100μg/ml浓度的bsa标准溶液；
[0139]
考马斯亮蓝g-250试剂配制，取100mg考马斯亮蓝g-250溶于95％乙醇中，加入100ml质量分数为85％的磷酸，之后加95％乙醇定容至1000ml。
[0140]
标准曲线溶液的配制如表2所示：
[0141]
表2标准曲线溶液配比
[0142][0143]
系列浓度标准曲线溶液配制好后静置5min，然后测定595nm波长处的a值，以a值为纵坐标、样品相应标准蛋白质含量为横坐标绘制得到标准曲线。
[0144]
未知样品测定方法同上，在标准曲线上查出对应a值相当于标准蛋白的量，计算得到未知样品的蛋白浓度。
[0145]
对实施例5～8制备得到的固定化酶进行上述测试，结果如图3所示。从图中分析可知，本发明实施例5制备的固定化酶的酶活力以及载酶量明显高于实施例8的，表明采用杂氧酸酐对壳聚糖微球表面进行修饰后，得到固定化材料用于固定化酶工艺中，其载酶能力显著提升，制得的固定化酶的酶活性也得到显著提升。
[0146]
操作稳定性测定
[0147]
取200mg固定化酶样品，加入底物溶液4.0ml和0.05m浓度磷酸缓冲溶液(ph7.5)5.0ml，38℃下恒温水浴反应15min，测定酶活力(方法同上)；回收固定化酶，并用磷酸缓冲液反复清洗，之后相同条件下重复上述步骤8次，再测定反应没活力，计算酶活力下降率表征样品操作稳定性。
[0148]
对实施例5～8制备得到的固定化酶进行上述测试，结果如表3所示：
[0149]
表3操作稳定性测试结果
[0150][0151]
从表3中数据分析可知，本发明实施例5制备的固定化酶的酶活力下降率明显低于实施例8的，表明采用杂氧酸酐对壳聚糖微球表面进行修饰后，得到固定化材料用于固定化酶工艺中，制得的固定化酶的操作稳定性也得到显著增强。其原因可能在于采用杂氧酸酐表面修饰微球后，其表面引入更多活性官能团，对脂肪酶的连接能力进一步增强，并且进一步减少在使用和回收过程中外界环境作用下对酶产生的不可逆变化的影响，有效改善固定化酶的使用稳定性。
[0152]
试验例4：
[0153]
表面活性剂表面张力测定
[0154]
测试采用滴体积法进行。具体操作包括：
[0155]
配制10mg/l浓度表面活性剂水溶液待用；
[0156]
取待测表面活性剂溶液润洗玻璃套管和滴体积管后注入一定体积待测液，然后将
滴体积管下端插入待测液液面之下，调节洗耳球吸入一定量待测液，后提起使其下端处于液面之上，缓慢挤压洗耳球挤出第一滴液滴悬挂，并在5min左右自然低落；之后再缓慢调节洗耳球使滴体积管下端残留的部分溶液液面与滴体积管末端的横截面相平，保持视线与滴体积管内液面水平，当滴体积管内液面高度不再发生变化时，记录液面示数v1；接着缓慢调节洗耳球，挤出饱满液滴悬挂，并使其在4min左右滴落，再调节洗耳球使滴体积管下端残留的部分溶液液面与滴体积管末端的横截面相平，当滴体积管内液面高度不再发生变化时，记录液面示数v2；最后所得液滴的体积v＝v
2-v1；并根据下列公式计算表面张力：
[0157][0158]
式中，γ代表表面张力，mn
·
m-1
；f代表校正因子，为v/r3的函数；
△
ρ代表密度差，g/ml；r代表滴体积管末端横截面半径，m。
[0159]
对实施例3制备得到的新型表面活性剂进行上述测试，结果如表4所示：
[0160]
表4表面张力测试结果
[0161][0162]
从表4中数据分析可知，本发明实施例3制备的新型表面活性剂的表面张力明显低于皂素的，表明本发明成功制备得到新型结构的表面活性剂，其具有优异的表面活性性能，且表面张力要低于现有技术的，能够更好地应用于微生物发酵工程中。
[0163]
表面活性剂对菌株发酵影响测定
[0164]
实验测定不同发酵时间下，发酵液的od
600
值，并对实施例1-3中菌株发酵过程进行监控，结果如图4所示。从图中分析可知，相比于未添加任何表面活性剂的菌株发酵过程，在24-48h时便出现了菌体结团的现象，而添加皂苷以及本发明制备的新型表面活性剂的菌株发酵过程，后期od
600
未出现大幅下降，并且菌体结团现象出现的时间明显后推，起到良好的分散作用。同时，实施例3相比于实施例2发酵过程中虽然结团现象出现时间相差不大，但后续od
600
值下降程度要稍低于实施例2的，表明本发明制备得到新型结构的表面活性剂对微生物菌株分散作用具有更持久、稳定的效果。此外，实施例3制备得到新型结构的表面活性剂添加后，发酵产生了更多的有机酸和有机醇，对微生物菌株生长具有一定的促进作用，产物总碳浓度增长幅度明显高于实施例2中添加皂素的。
[0165]
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
[0166]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。