一种预测昼夜节律紊乱患者氯吡格雷抵抗的试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物检测，具体而言，涉及一种预测昼夜节律紊乱患者氯吡格雷抵抗的试剂盒及方法。

背景技术：

1、作为一种已经入选who基本药物目录的抗血小板药物，氯吡格雷被用来预防急性冠脉综合征(acs)心肌缺血的再次发生或预防经皮冠脉介入术(pci)后冠脉支架内血栓的形成，与阿司匹林合用所组成的“双联抗血小板治疗”方案是acs或pci植入支架后临床抗血小板治疗的基石，为世界各国广泛采用。

2、氯吡格雷抵抗(cr)是冠心病pci术后一种常见的药物疗效反应，是指病人在服用推荐(或标准)剂量的氯吡格雷后因各种原因不能达到预期的抗血小板作用而导致的药物临床疗效较差或产生不良心血管事件的现象。据估计，约10％–45％的服药病人可能存在氯吡格雷抵抗。判断服药病人有无氯吡格雷抵抗的常用方法是检测服药1月后adp诱导的血小板聚集抑制率或用药1月后的血小板高反应单位。尤其对于昼夜节律紊乱患者，其snp及dna甲基化修饰在氯吡格雷不同抗血小板效应中起关键作用。然而，目前各种检测血小板聚集率方法的重现性较差，难以精准指导昼夜节律紊乱患者临床合理使用氯吡格雷。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种预测昼夜节律紊乱患者氯吡格雷抵抗的试剂盒，根据测序位点的表型，分析cr出现的风险，为早期干预提供借鉴，减少冠心病合并昼夜节律紊乱患者pci术后不良心血管事件的发生。

2、为达到上述目的，本发明提供一种预测昼夜节律紊乱患者氯吡格雷抵抗的试剂盒，所述试剂盒包括甲基化引物、焦磷酸测序引物、pcr扩增试剂、焦磷酸测序试剂、snp位点引物和snp位点测序反应试剂。

3、作为优选，所述snp位点引物包括，

4、snp位点引物1(seq no1)：

5、rs1801260上游引物aagcaaacccctgacatggc；

6、snp位点引物2(seq no2)：

7、rs1801260下游引物ggcccattaagagttactcagatgacc；

8、snp位点引物3(seq no3)：

9、rs10861688上游引物tgccacccaagcctgaaaaca；

10、snp位点引物4(seq no4)：

11、rs10861688下游引物ggctgaggcaagagaatcct；

12、snp位点引物5(seq no5)：

13、rs8192439上游引物tgcttcagtttctccacctg；

14、snp位点引物6(seq no6)：

15、rs8192439下游引物gaaccctttaagaagtgatatgtttgttc；

16、snp位点引物7(seq no7)：

17、rs2007044上游引物cgtagaccatctctgggtgatg；

18、snp位点引物8(seq no8)：

19、rs2007044下游引物cagggacaatggtaatgcctatctgtg；

20、snp位点引物9(seq no9)：

21、rs3745406上游引物ccttgtgatccgcccgcctt；

22、snp位点引物10(seq no10)：

23、rs3745406下游引物ggccactaggaccctcagatca；

24、作为优选，所述甲基化引物包括，

25、甲基化引物1(seq no11)：

26、cg02447122上游引物ataggtaaaagtaggggtagggt；

27、甲基化引物2(seq no12)：

28、cg02447122下游引物5’-aaaattcctaaaccttccttctatttact；

29、甲基化引物3(seq no13)：

30、cg13254556上游引物5’-ggtggtttattttttttaggtagtga；

31、甲基化引物4(seq no14)：

32、cg13254556下游引物atacaaattctttcccaaaaacttactta；

33、甲基化引物5(seq no15)：

34、cg22507406上游引物taggttatttggaaaaggtatttaattagg；

35、甲基化引物6(seq no16)：

36、cg22507406下游引物5’-aaccaaactaatcttaaactcctaac。

37、作为优选，所述焦磷酸测序引物包括，

38、焦磷酸测序引物1(seq no17)：

39、cg02447122测序引物gggtagggttaggtt；

40、焦磷酸测序引物2(seq no18)：

41、cg13254556测序引物cttaaaaatctatttccccatc；

42、焦磷酸测序引物3(seq no19)：

43、cg22507406测序引物atttaattaggtgaaggagaaaata。

44、作为优选，所述pcr扩增试剂为pyromark pcr master mix试剂，所述snp位点测序反应试剂为genomelab snpstream基因分型系统中的snp测序反应试剂。

45、作为优选，所述焦磷酸测序试剂包括dna聚合酶、apyrase、luciferase、atpsulfurylase、脱氧核糖核苷三磷酸复合物dntp和底物。

46、作为优选，所述底物包括5’-磷醯硫酸和萤光素。

47、本发明的另一个目的在于提供一种预测昼夜节律紊乱患者氯吡格雷抵抗的方法，所述方法应用上述试剂盒，包括如下步骤：

48、s1、利用qiaamp dna blood mini试剂盒，从外周血中提取基因组dna；

49、s2、利用步骤s1中得到的基因组dna依次进行pcr扩增和焦磷酸测序得到基因组dna上adcy3 cg02447122、gria2 cg13254556和per3 cg22507406的甲基化位点的序列；

50、s3、采用genomelab snpstream基因分型系统对步骤s1中得到的基因组dna进行基因分型，从而得到基因组dna上clock rs1801260、cry1 rs10861688、cry1 rs8192439、cacna1c rs2007044、prkcg rs3745406的snp位点的序列；

51、s4、利用步骤s2和步骤s3得到的甲基化位点的序列和snp位点的序列，分析氯吡格雷抵抗出现的风险。

52、作为优选，所述步骤s2中，pcr扩增的具体步骤如下：

53、s21、通过epitech bisulfite kits对步骤s1中得到的基因组dna进行双重硫化；

54、s22、对步骤s21中得到的经双重硫化后的基因组dna进行洗脱；

55、s23、采用甲基化引物和pcr扩增试剂对洗脱后的基因组dna进行pcr扩增，具体的反应条件为：(1)进行3个循环的：95℃、15min；(2)进行3个循环的：94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s；(3)进行1个循环的：72℃、10min；(4)将反应温度维持在4℃。

56、作为优选，所述步骤s2中，焦磷酸测序的具体步骤如下：

57、s24、将焦磷酸测序引物加入到步骤s23生成的pcr产物中，然后加入除脱氧核糖核苷三磷酸复合物dntp以外的焦磷酸测序试剂混合；

58、s25、向测序反应体系中加入其中一种脱氧核糖核苷三磷酸复合物dntp，通过焦磷酸仪的光学系统捕捉荧光信号后得到峰值；

59、s25、重复步骤s25，分三次加入剩余三种直脱氧核糖核苷三磷酸复合物dntp，并得到四组峰值；

60、s26、根据步骤s25得到的四组峰值推算出步骤s1中基因组dna中adcy3cg02447122、gria2 cg13254556和per3 cg22507406的甲基化位点的序列，并分析出氯吡格雷抵抗出现的风险。

61、当被测患者满足至少一项以下结果：1、clock rs1801260的基因型为ag或gg；2、cry1 rs10861688的基因型为tc或tt；3、cry1 rs8192439的基因型为tc或tt；4、cacna1crs2007044的基因型为ag或gg；5、prkcg rs3745406的基因型为tc或cc；6、adcy3cg02447122的甲基化程度大于10％；7、gria2 cg13254556的甲基化程度小于40％；8、per3cg22507406的甲基化程度小于70％；则该昼夜节律紊乱患者存在氯吡格雷抵抗的可能性较高；若检测患者不满足其中任意一条，则该昼夜节律紊乱患者存在氯吡格雷抵抗的可能性较低。

62、与现有技术相比，本发明提供了一种早期、简便、精准的预测昼夜节律紊乱患者氯吡格雷抵抗的试剂盒及预测方法，根据测序位点的表型，分析cr出现的风险，为早期干预提供借鉴，减少冠心病合并昼夜节律紊乱患者pci术后不良心血管事件的发生。