一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒的制作方法

本发明属于兔病毒性出血症检测，具体涉及一种同时检测rhdv1和rhdv2的引物、探针及其试剂盒。

背景技术：

1、兔病毒性出血症是由兔病毒性出血症病毒(rhdv)引起的一种急性、高致死性、高度接触性传染病，俗称兔瘟。兔病毒性出血症病毒属于杯状病毒科兔病毒属，兔病毒属的成员还包括非致病性兔杯状病毒(rcv)、欧洲褐色野兔综合征病毒(ebhsv)，rhdv、rcv、ebhsv具有相同的遗传特性，但亲缘关系较远。2010年以前分离的兔病毒性出血症病毒分为g1-g6六个基因型，为通常所说的经典兔瘟病毒，其中g6为抗原变异株(也称rhdva)。2010年首次在法国发现一种遗传特性、抗原性有别于经典兔病毒性出血症病毒的新毒株rhdv2(又称rhdvb)，并在欧洲、大洋洲、美洲扩散。

2、rhdv2与经典兔病毒性出血症病毒感染致死家兔具有类似的典型症状，但经典兔病毒性出血症病毒仅对2月龄以上家兔易感，而rhdv2对15日龄以上家兔、野兔均易感，且用经典兔病毒性出血症病毒制备的疫苗并不能避免易感兔感染rhdv2。2020年4月我国在四川金堂某兔场首次发现rhdv2感染，致死率高达73.3％。该病毒对我国养兔业和生态环境安全造成了极大的威胁。

3、兔出血症(rabbit haemorrhagic disease，rhd)是由兔出血症病毒(rabbithaemorrhagic disease virus，rhdv)引起的一种急性、高传染性、高致病性疾病。经典的rhdv(也称rhdv1)只感染家兔，且易感染2月龄以上的家兔，染病后家兔的病死率达90％，常于感染后48～72h死亡，死亡家兔具有呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器水肿、淤血出血为特征，在全球许多国家和地区均有报道，呈爆发性流行，发病率和死亡率可高达90％，给养兔业造成极大经济损失。该病于1984年首先在中国被报道，随后迅速在全球大部分地区流行，同时rhdv1也发生了遗传变异。从系统发育关系上看，rhdv1可以分为g1～g6这6个基因型(gi.1)，中国的流行毒株主要为g2、g6型。2010年，在法国首次发现了rhdv的新毒株，研究者将其命名为rhdv2。2020年4月，在国内首次发现rhdv2型毒株。rhdv2与rhdv1毒株g1～g6型感染家兔致死的典型症状相似，但在遗传特性及抗原性上有很大差异，rhdv1易感染2月龄以上的家兔，未断奶仔兔不易感，rhdv2会感染不同日龄的家兔，未断奶仔兔最易感。同时由于rhdv1和rhdv2抗原之间的变异较大，导致它们无交叉保护性，这意味着使用经典兔瘟疫苗免疫接种后的各种日龄家兔均无抵抗rhdv2攻击的有效保护力。因此对发病家兔进行兔瘟诊断时，区分感染的是rhdv1还是rhdv2对疾病的预防控制具有十分重大的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种同时检测rhdv1和rhdv2的引物、探针及其试剂盒，本发明分别针对rhdv1型和rhdv2型的vp60基因分别设计两个引物探针组，同时两组探针分别采用不同的荧光基团，因此用于rhdv1和rhdv2的单独检测，同时还可以对同一样品进行两种病毒的同时检测。

2、为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种同时检测rhdv1和rhdv2的引物，引物序列如seq id no.1～4所示，具体如下：

4、rhdv1-f：ccacagaacaacccattcaca(seq id no.1)

5、rhdv1-r：gtatcacagccgcgacca(seq id no.2)

6、rhdv2-f：cggtgacarttggactttcactc(seq id no.3)

7、rhdv2-r：ccgcatagaagtatccatcaacac(seq id no.4)。

8、一种同时检测rhdv1和rhdv2的探针，其核苷酸序列分别如seq id no.5和seq idno.6所示，探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团，荧光基团为hex或fam；猝灭基团为bhq1；具体序列如下：

9、probe rhdv1：hex-ccgcttcatagttgctggatcagg-bhq1(seq id no.5)

10、probe rhdv2：fam-acttygcttccggcttcatggaac-bhq1(seq id no.6)。

11、一种同时检测rhdv1和rhdv2的核酸组合物，包括上述引物和探针。

12、一种同时检测rhdv1和rhdv2的试剂盒，包括上述引物和探针。

13、上述核酸组合物，或试剂盒在同时对rhdv1和rhdv2进行实时荧光定量pcr检测中的用途。

14、进一步地，实时荧光定量pcr反应体系包括：2×rt-pcr buffer mix 10μl、上游引物0.2～2.0μl、下游引物0.2～2.0μl、探针0.2～2.0μl、酶0.25～2μl、样品1～5μl，最后用edpc-ddh2o补足至20μl。

15、进一步地，实时荧光定量pcr反应条件为：

16、(1)反转录：42℃30min，(2)变性：95℃30秒；(3)扩增：95℃5秒，58～62℃20～40秒，30～45个循环，在60℃采集荧光信号。

17、本发明的有益效果：

18、本发明分别针对rhdv1型和rhdv2型的vp60基因分别设计两个特异性引物探针组，同时两组探针分别采用不同的荧光基团，因此用于rhdv1和rhdv2的单独检测，同时还可以对同一样品进行两种病毒的同时检测。

技术特征：

1.一种同时检测rhdv1和rhdv2的引物，其特征在于，所述引物序列如seq id no.1～4所示。

2.一种同时检测rhdv1和rhdv2的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列分别如seqid no.5和seq id no.6所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其特征在于，所述荧光基团为hex或fam；猝灭基团为bhq1。

5.一种同时检测rhdv1和rhdv2的核酸组合物，其特征在于，包括权利要求1所述引物，以及权利要求2～4任一项所述探针。

6.一种同时检测rhdv1和rhdv2的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物，以及权利要求2～4任一项所述的探针。

7.权利要求5所述核酸组合物，或权利要求6所述试剂盒在同时对rhdv1和rhdv2进行实时荧光定量pcr检测中的用途。

8.根据权利要求7所述用途，其特征在于，实时荧光定量pcr反应体系包括：2×rt-pcrbuffer mix 10μl、上游引物0.2～2.0μl、下游引物0.2～2.0μl、探针0.2～2.0μl、酶0.25～2μl、样品1～5μl，最后用edpc-ddh2o补足至20μl。

9.根据权利要求7所述用途，其特征在于，实时荧光定量pcr反应条件为：(1)反转录：42℃，30min，(2)变性：95℃，30s；(3)扩增：95℃，5s，58～62℃20～40s，30～45个循环，并在60℃采集荧光信号。

技术总结
本发明公开了一种同时检测RHDV1和RHDV2的引物、探针及其试剂盒。引物序列如SEQ ID NO.1～4所示，探针序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有猝灭基团。本发明分别针对RHDV1型和RHDV2型的VP60基因分别设计两个引物探针组，同时两组探针分别采用不同的荧光基团，因此用于RHDV1和RHDV2的单独检测，同时还可以对同一样品进行两种病毒的同时检测。

技术研发人员：杜德燕,邱文英,罗颖,易洁,申建青,李金海
受保护的技术使用者：华派生物工程集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13