先天性心脏病相关DGKD基因新发变异位点及其应用

本发明属于分子诊断和基因检测，涉及先天性心脏病候选基因的新发变异及其与先天性心脏病的相关性，具体涉及基因检测的dgkd基因新发变异的鉴定和应用方法，尤其涉及一种先天性心脏病相关dgkd基因新发变异位点及其应用。

背景技术：

1、先天性心脏病(congenital heart disease,chd)是一大类涉及心脏结构和功能缺陷的心脏发育畸形，在活产婴儿中其发生率为0.5～1％。chd是最常见的人类出生缺陷，严重危害着婴幼儿健康，其中青紫型先心病是导致婴幼儿复杂畸形和高死亡率的主要原因。中国每年出生10多万先天性心脏病患儿，其中约80％为未伴有综合征的单纯性chd。虽然，现代遗传学和影像学对chd的遗传和分子机制研究已经取得很大进步，但是目前很大部分chd患者发病原因仍然不明，并且主要采用手段手术治疗。chd患者即使可以通过外科手术矫正而存活，将来仍面临出现肺动脉高压、心衰并发症等严峻的问题，给患者及其家庭带来巨大的痛苦和经济负担。阐明chd发病机制是提高chd早期干预、防控及治疗的基础，对于提高我国儿童健康和出生人口素质具有重大的科学价值与社会意义。通过大规模的chd家系全基因组测序并结合临床基因检测技术，将有助于完善我国chd的基因组学及临床数据以及进一步阐明chd的发病机制，为其分子诊断提供理论依据，也将为类似的疾病病因学的研究提供新思路。

2、已知可以引起chd的因素主要为环境因素和遗传因素。环境因素主要包括妊娠期服用药物、病毒感染、环境污染、射线辐射等。相较于复杂的环境因素，遗传因素易于定量分析。自nkx2-5基因杂合突变被首次证实可引起chd以来，遗传因素在chd发生发展中的作用越来越受到重视。迄今，在人类已经发现数十个与单纯性chd相关的基因，其中包括心脏形成过程中的转录因子和调节因子基因(如nkx2-5，tbx1和gata4)、发育信号通路分子基因(如notch2和jag1)、心脏结构基因(如eln和myh6)等。相关基因功能缺失性(loss offunction，lof)突变和功能增强性(gain of function，gof)突变均可导致chd。但目前已知的单基因变异仅能解释3～5％的单纯性chd，新的chd相关基因的发现和鉴定是亟待解决的科学问题。

3、chd病因复杂，具有多种临床表型。例如：法洛四联症(tetralogy of fallot,tof)、肺动脉闭锁/室间隔缺损(pulmonary atresia/ventricular septal defect,pa/vsd)、永存动脉干(permanent truncus arteriosus,pta)、主动脉弓离断(interruptedaortic arch,iaa)、大动脉转位(transposition of the great arteries,tga)和右室双出口(double outlet right ventricle,dorv)等。阐明不同类型chd遗传特征及发病机制，将极大推动chd病因学的研究，为其分子诊断及早期干预提供理论支持。由于先心病发生机制复杂，因此在家系中选择合适的样本、采取合适的策略进行研究显得尤其重要。通过对先心病家系的收集不仅为探索先心病发生机制提供有利保障，家系调查还可能发现新的疾病表型，揭示致病基因新的功能，为致病基因研究提供方向。

4、近年来，高通量测序技术的发展为chd等复杂疾病的遗传病因研究带来了新的机遇。迄今最大规模的chd队列(2871例先证者，其中2645个核心家系)全外显子组数据分析表明，约440个基因的新发变异与chd相关，其中新发常染色体显性遗传变异和常染色体隐性遗传变异分别占8％和2％；page等通过全外显子组测序技术在829例法洛氏四联症(tof)病人中发现致病变异在notch1和flt4中显著聚集，这2个基因的变异可以解释该研究所招募tof病例的6.9％；liu等通过对大动脉转位患儿及核心家系(trio)的全外显子组测序研究，发现致病突变富集于纤毛相关基因，且部分病例表现出寡基因或多基因遗传模式。然而，目前对于chd遗传致病因素的研究仍主要集中于蛋白编码基因，在此之外还存在着大量的非编码区域，其与胚胎心脏发育过程密切相关，也是导致chd的关键因素。通过全基因组测序分析临床样本不仅可以检测常见变异及罕见变异，还将同时获得蛋白编码区及非编码区的变异信息，是全面揭示chd遗传病因的必经之路。

5、dgkd基因编码一种细胞质酶即甘油二酯激酶，使二酰基甘油磷酸化以产生磷脂酸。二酰基甘油和磷脂酸是两种脂质，在信号串联中充当第二信使。它们的细胞浓度受到编码蛋白的调控，因此被认为在细胞信号转导中起着重要作用。此外，dgkd通过控制二酰基甘油的水平，调节例如pkc和egf受体信号通路，并在发育过程中发挥关键作用。有报道指出dgkd在癫痫发作的病因学中可能发挥作用。虽然已经有许多基因上的各种类型的变异与先天性心脏病相关性的报道，但未有dgkd基因与先天性心脏病相关性的报道，更没有其新发变异与先天性心脏病相关性的报道。因此，本发明首次提出dgkd基因在先天性心脏病筛查中应用价值，不仅对先天性心脏病的早期干预有重大意义，也为先天性心脏病发病机制的探索提供重要线索。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种先天性心脏病相关dgkd基因新发变异位点及其应用。本发明为研究dgkd基因新发变异与先天性心脏病的关系奠定了基础，为先天性心脏病的早期干预提供理论依据，也为先天性心脏病发病机制的探索提供重要线索。

2、本发明的目的是通过以下的技术方案实现的，

3、第一方面，本发明提供一种分离的含新发变异位点的核苷酸，所述核苷酸的序列如seq id no:1所示，所述新发变异位点位于第35949位rs542595931为g→a和第80316位rs1345260651为a→g。

4、第二方面，本发明提供一种分离的核苷酸，所述核苷酸的序列如seq id no：1所示，且第35949位为g同时第80316位为a。

5、第三方面，本发明提供一种所述分离的含新发变异位点的核苷酸在作为先天性心脏病的分子标记物，或制备辅助筛查或检测先天性心脏病的试剂或试剂盒中的用途。

6、作为本发明的一个实施方案，所述试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。

7、作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

8、(a)用于检测一种或两种所述新发变异位点的特异性引物；

9、(b)用于检测一种或两种所述新发变异位点的特异性探针；

10、(c)用于检测一种或两种所述新发变异位点的芯片；

11、(d)用于检测一种或两种所述新发变异位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

12、作为本发明的一个实施方案，所述新发变异位点位于第35949位，rs542595931为g→a，所述引物为：

13、正向引物5’-tctgacagatgccagcgtag-3’seq id no.2，

14、反向引物5’-actgttgttgacgtttttggt-3’seq id no.3；

15、所述新发变异位点位于第80316位，rs1345260651为a→g，所述引物为：

16、正向引物5’-catggaccacttctcaggga-3’seq id no.4，

17、反向引物5’-ctcacggcacacattgcagta-3’seq id no.5。

18、第四方面，本发明提供一种辅助筛查或检测先天性心脏病的试剂盒，所述试剂盒包括：根据如seq id no：1所示序列的新发变异位点rs542595931和rs1345260651设计的引物对。

19、作为本发明的一个实施方案，所述新发变异位点位于第35949位，rs542595931为g→a，所述引物对为：

20、正向引物5’-tctgacagatgccagcgtag-3’seq id no.2，

21、反向引物5’-actgttgttgacgtttttggt-3’seq id no.3；

22、所述新发变异位点位于第80316位，rs1345260651为a→g，所述引物对为：

23、正向引物5’-catggaccacttctcaggga-3’seq id no.4，

24、反向引物5’-ctcacggcacacattgcagta-3’seq id no.5。

25、第五方面，本发明提供一种所述的试剂盒的非诊断目的使用方法，包括如下步骤：

26、s1，提取三口家系样品dna；

27、s2，利用所述引物对进行扩增，得扩增产物；

28、s3，采用sanger测序方法，检测家系子女样品中是否存在如seq id no:1所示的新发变异位点rs542595931和rs1345260651。

29、作为本发明的一个实施方案，步骤s3包括如下步骤：采用abi 3730xl pcr仪，对所取样品的位点rs542595931和rs1345260651进行分型，检测第35949位和第80316位是否存在遗传变异。

30、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述扩增产物的长度为50-150bp。

31、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述引物的长度为15-25bp。

32、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述扩增的扩增反应体系总体积为50μl，其中，

33、

34、作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述扩增反应条件：94℃2mins；40×(94℃30s；58℃30s，72℃30s)；72℃10mins。

35、第六方面，本发明提供一种用于检测所述核苷酸的snp位点的引物对，所述核苷酸的序列如seq id no:1所示；

36、所述新发变异位点位于第35949位，rs542595931为g→a，所述引物对为：

37、正向引物5’-tctgacagatgccagcgtag-3’seq id no.2，

38、反向引物5’-actgttgttgacgtttttggt-3’seq id no.3；

39、所述新发变异位点位于第80316位，rs1345260651为a→g，所述引物对为：

40、正向引物5’-catggaccacttctcaggga-3’seq id no.4，

41、反向引物5’-ctcacggcacacattgcagta-3’seq id no.5。

42、第七方面，本发明还提供了一种分离的dgkd氨基酸序列，其具有一个或多个选自下组的突变：第59位氨基酸val(v)→ile(i)，第121位氨基酸asn(n)→thr(t)。

43、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明为研究dgkd基因新发变异与先天性心脏病的关系奠定了基础，为预测罹患先天性心脏病风险提供分子靶标，同时也为基于该基因的先天性心脏病早期筛查提供理论依据。