一种皮炎外瓶霉基因敲除的核酸组合物、方法及皮炎外瓶霉GAL4缺陷株

本发明涉及一种皮炎外瓶霉基因敲除的核酸组合物、方法及皮炎外瓶霉 gal4缺陷株，属于基因工程。

背景技术：

1、近年来，随着医学水平的发展，实体器官移植、骨髓干细胞移植技术不断成熟，以及糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用，机会性致病真菌感染的发生率显著增高1。除了常见的曲霉病及念珠菌病，暗色真菌感染也在逐年增多2。暗色真菌，俗称暗色酵母样真菌，具有两大典型的特征：其一,菌落呈褐色或黑色，可产生硬壳细胞；其二，双相生长，菌丝可以转变为酵母样孢子。临床中，最常见的致病性暗色真菌为皮炎外瓶霉2,3。

2、皮炎外瓶霉广泛存在于环境中，尤其是高温、潮湿的腐木、植物碎屑及土壤等自然环境，同时也见于室内潮湿环境如桑拿、洗手台等4,5。它不仅侵犯免疫缺陷宿主，还可侵犯免疫正常宿主，引起局限性或系统性感染6,7；更值得注意的是，在亚裔人群中，皮炎外瓶霉可引起中枢神经系统感染，致死率极高8；此外，皮炎外瓶霉还是肺纤维化患者常见的肺部定植菌之一，与患者病情的加重相关9,10。皮炎外瓶霉感染多需要系统使用抗真菌药物治疗。然而现有抗真菌药物对皮炎外瓶霉的作用极其有限11,12；皮肤软组织感染多迁延反复，播散性感染死亡率达 40％12，中枢神经系统感染的死亡率则高达90％13。因而，研究皮炎外瓶霉的毒力因素、药物敏感性等有助于开发新型抗真菌药物联合，促进临床抗真菌效果，改善感染后的病死率。

3、基因敲除是研究致病真菌基因功能的重要方法之一。然而，致病真菌敲除技术的研究多限于遗传转化方法趋于成熟的模式菌种，例如曲霉、念珠菌等。文献报道的皮炎外瓶霉基因敲除有限，liu等报告了对皮炎外瓶霉wdchs5p等基因的敲除14-16及表型研究，但其基因敲除方法需要使用质粒载体，操作复杂、耗时。

4、参考文献：

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技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种精准高效的适用于皮炎外瓶霉的基于pcr的电转染基因敲除方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种用于皮炎外瓶霉基因敲除的核酸组合物，包括：

3、用于扩增目的基因上游片段的引物对：seq id no:1～2；

4、用于扩增目的基因下游片段的引物对：seq id no:3～4；

5、用于扩增筛选标记hph基因片段的引物对：seq id no:5～6；

6、用于将目的基因上下游片段与筛选标记hph基因片段融合的引物对：seq id no:7～8；

7、以及验证筛选标记引物对：验证上游序列的引物seq id no:9～15和验证下游序列的引物seq id no:16～22。

8、本发明还提供了上述用于皮炎外瓶霉基因敲除的核酸组合物在制备用于皮炎外瓶霉基因敲除的试剂和/或试剂盒中的应用。

9、本发明还提供了一种高效精准的皮炎外瓶霉基因敲除方法，该基因敲除方法中采用上述的皮炎外瓶霉基因敲除的核酸组合物，具体包括如下步骤：

10、步骤1：利用pcr扩增目的基因的上下游基因片段和筛选标记hph基因片段；

11、步骤2：采用三段融合的方法，将目的基因的上下游基因片段和hph基因片段进行融合；

12、步骤3：将步骤2所得融合片段通过电穿孔转化，将转化子涂布于含潮霉素选择培养琼脂平板上筛选；最后通过pcr进行鉴定。

13、本发明还提供了一种上述的皮炎外瓶霉基因敲除方法获得的皮炎外瓶霉 gal4缺陷株。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

15、本发明针对现有技术中皮炎外瓶霉wdchs5p等基因的敲除需要使用质粒载体，操作复杂、耗时，效率低下等问题提出了一种两步pcr联合电转染进行皮炎外瓶霉基因敲除方法，通过pcr扩增和融合pcr构建的三段敲除盒子通过电转染能够精准与皮炎外瓶霉结合，经潮霉素培养筛选，从而获得皮炎外瓶霉 gal4缺陷株，该基因敲除方法耗时低，效率高。