一种高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻及其制备方法

本发明属于基因工程及生物工程领域。具体涉及一种生产异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻及其构建方法与应用。

背景技术：

1、异麦芽酮糖又名帕拉金糖，是一种还原性双糖，是蔗糖的同分异构体，由葡萄糖与果糖以α-1,6-糖苷键结合而成，天然存在于蜂蜜和甘蔗汁中。它具有与蔗糖相似的物理和感官特性，甜度只有蔗糖的一半；此外异麦芽酮糖还具有能量值低，消化吸收率低的特点，它能缓慢地将葡萄糖释放到血液中，且不刺激胰岛素的生成，从而避免葡萄糖水平的突然上升和下降，有益于糖尿病患者食用；同时它不容易被形成牙菌斑的可变链球菌所利用，能够避免龋齿的发生。海藻酮糖也是一种还原性二糖，其功能特性与异麦芽酮糖基本类似，因此异麦芽酮糖和海藻酮糖作为健康的食品添加剂，在食品工业中均具有广阔的市场应用前景。

2、目前国内外生产异麦芽酮糖和海藻酮糖、普遍采用的方法为基于生物催化的蔗糖异构化法。以大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等异养微生物为底盘，在蔗糖异构酶的作用下，微生物能将蔗糖异构化为异麦芽酮糖和海藻酮糖。但是采用以上底盘进行工业生产发酵时需大量添加葡萄糖、蔗糖等糖原料来提高目标产物的积累，会增加制糖产业的经济和环境成本。而自养微生物如蓝细菌等可以以co2为唯一碳源实现细胞生长，相较于异养微生物能节省发酵成本，并同时起到固碳减排和清洁生产的效果，因此也受到科学界越来越多的关注。

3、蓝细菌因具有结构简单、生长快速、易于进行遗传操作、光合效率高等优势被认为是最具潜力的光合生物制造的微生物底盘之一。随着合成生物学和代谢工程技术手段的快速发展，目前已实现以蓝细菌为光合平台合成多种天然或非天然代谢产物，包括糖、醇、酸、烷、烯、酮、脂肪酸、脂肪醇和萜类等。但是，尚无报道将蓝细菌用于商业化生产异麦芽酮糖和海藻酮糖。因此，以蓝细菌为底盘，开发高效、绿色的新型异麦芽酮糖和海藻酮糖合成技术对于提高产品竞争力和市场接受度具有重要意义。

技术实现思路

1、在前期研究中，我们发现，在聚球藻pcc7942转入蔗糖转运蛋白的表达框后，藻细胞向外大量分泌蔗糖。从理论上讲，蔗糖异构酶可以蔗糖为底物，将蔗糖转化为异麦芽酮糖，当藻细胞内表达蔗糖转运蛋白导致蔗糖向外分泌时，细胞内的蔗糖量降低，即便向藻细胞中转入与异麦芽酮糖合成相关的酶，细胞合成异麦芽酮糖的效率也应当降低才对。

2、然而，意外地，我们发现，当向细胞内转入了蔗糖转运蛋白的表达框后，再转入蔗糖异构酶的表达框，结果异麦芽酮糖的合成效率不仅没有降低，反而提高了，甚至达到了数百毫克级的胞外异麦芽酮糖含量；并且，除了异麦芽酮糖外，海藻酮糖的含量和占比都大幅提高。因此，我们有望实现异麦芽酮糖和海藻酮糖的商业生产。

3、基于以上发现，本发明提供了一种制备高产异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻的方法，包括向底盘蓝细菌转入蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框的步骤，所述蔗糖异构酶为具有将蔗糖转化为异麦芽酮糖或海藻酮糖能力的蔗糖异构酶，所述底盘蓝细菌为所有能够产生蔗糖的蓝细菌，可为环境中直接分离的能够产生蔗糖的蓝细菌，或通过遗传改造之后使得能够生产蔗糖的蓝细菌。

4、在一个具体实施方案中，所述底盘蓝细菌为聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。例如，我们通过实验发现，聚球藻pcc7942、集胞藻pcc6803、聚球藻 utex2973、鱼腥藻pcc 7120、聚球藻pcc7002都可以通过本发明的方法来实现异麦芽酮糖和海藻酮糖的生产。

5、在一个具体实施方案中，所述蔗糖转运蛋白表达框中，蔗糖转运蛋白的蛋白序列如seq id no:10所示。

6、我们试验了大部分我们能获得的具有将蔗糖转化为异麦芽酮糖或海藻酮糖能力的蔗糖异构酶，包括来源于沙雷氏菌属(serrati)、欧文氏菌属 (erwinina)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、分散泛菌属(pantoea dispers)、红色精朊杆菌(protaminobacter rubrum)的蔗糖异构酶，发现都能大幅提高异麦芽酮糖和海藻酮糖的含量。

7、在一个具体实施方案中，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶为来源于erwiniarhapontici nx-5、raoultella terrigena或klebsiella sp.lx3 的蔗糖异构酶，或其变体。

8、在一个具体实施方案中，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶的蛋白序列如seqid no:1、4、7之一所示。

9、上述基因表达框中，用于驱动蔗糖转运蛋白和蔗糖异构酶表达的启动子没有特别的限定，只需要能够在目标藻株内使目的基因强表达即可。例如，在聚球藻pcc7942中，可使用的启动子包括但不限于：cpcb1启动子、cpcb560 启动子、rbcl启动子等组成型强启动子，lac启动子、trc启动子等诱导型强启动子。

10、在一个具体实施方案中，所述蔗糖异构酶的核酸序列如seq id no:2、3、 5、6、8、9之一所示。

11、本发明还提供了通过上述方法得到高产异麦芽酮糖和海藻酮糖的蓝细菌。

12、本发明通过将蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框转入到聚球藻中，意外地使藻细胞具有了高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的功能，初步培养显示，本发明的工程藻株通过分泌使得培养物中含有高达570-776mg/l 的异麦芽酮糖和139-326mg/l的海藻酮糖，浓度极高，通过一定培养优化后，即可用于商业化生产。

技术特征：

1.一种制备高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻的方法，其特征在于，包括向底盘蓝细菌转入蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框的步骤，所述蔗糖异构酶为具有将蔗糖转化为异麦芽酮糖或海藻酮糖能力的蔗糖异构酶，所述底盘蓝细菌为能够产生蔗糖的蓝细菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底盘蓝细菌为环境中直接分离的能够产生蔗糖的蓝细菌，或通过遗传改造之后使得能够生产蔗糖的蓝细菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底盘蓝细菌选自聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述底盘蓝细菌选自聚球藻pcc7942、集胞藻pcc6803、聚球藻utex2973、鱼腥藻pcc 7120、聚球藻pcc7002。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖转运蛋白表达框中，蔗糖转运蛋白的蛋白序列如seq id no:10所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶为来源于沙雷氏菌属(serrati)、欧文氏菌属(erwinina)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、分散泛菌属(pantoea dispers)、红色精朊杆菌(protaminobacter rubrum)的蔗糖异构酶，或其变体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶为来源于erwiniarhapontici nx-5、raoultella terrigena或klebsiella sp.lx3的蔗糖异构酶，或其变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶表达框中，蔗糖异构酶的蛋白序列如seq id no:1、4、7之一所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述蔗糖异构酶的核酸序列如seq id no:2、3、5、6、8、9之一所示。

10.一种高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的蓝细菌，其特征在于，通过权利要求1-9中任一项所述的方法制备得到。

技术总结
本发明涉及一种制备高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的工程藻的方法，包括向底盘蓝细菌转入蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框的步骤，以及使用该方法制备的工程藻株。发明通过将蔗糖转运蛋白表达框和蔗糖异构酶表达框转入到聚球藻中，意外地使藻细胞具有了高产并分泌异麦芽酮糖和海藻酮糖的功能，初步培养显示，本发明的工程藻株通过分泌使得培养物中含有高达570‑776mg/L的异麦芽酮糖和139‑326mg/L的海藻酮糖，浓度极高，通过一定培养优化后，即可用于商业化生产。

技术研发人员：吕雪峰,吴彦楠,孙佳慧,栾国栋
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13