长链烷基酯胺类脂质化合物及其制备方法和在核酸递送方面的应用与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体地说，本发明涉及长链烷基酯胺类脂质化合物及其制备方法和在核酸递送方面的应用。


背景技术：

2.通过体外转录技术合成的核酸，借助酯质纳米颗粒递送系统运送到组织细胞内，由自身细胞非翻译系统翻译出目标蛋白，这些蛋白或是作为抗原激发免疫反应，或是补充细胞内缺少的蛋白以行驶功能，最终达到治疗的目的。基于核酸的治疗技术具有制备快速、成本低、安全等优点让它在众多的治疗方法中脱颖而出，被广泛应用于癌症、感染性疾病和罕见病治疗领域。然而，由于核酸本身不稳定，容易在体内被降解，稳定的递送系统的选择是该类药物研发的关键。
3.随着纳米脂质体技术的蓬勃发展，研究人员致力于开发新型的合成脂质以及提高脂质体的载药能力，于是阳离子脂质应运而生，用于有效转载带负电的药物，尤其是对于核酸类药物的递送备受关注。阳离子脂质一般有带正电的头部基团通过连接键（酰胺、酯、醚键）与疏水尾片段（胆固醇或脂肪链）相连组成，其结构是决定核酸类药物药效的重要因素。近年来，脂质分子得到了长足的发展，从永久的带电的阳离子脂质分子到可电离的阳离子脂质，已经有少数阳离子递送分子应用于临床并上市。
4.鉴于阳离子脂质分子的递送的优势，研究开发不同类型的靶向递送分子以增加药物在靶向器官的蓄积变得更受期待，本团队研发了一系列新的脂质分子化合物，具有一定的胃肠分布特点，在胃肠靶向药物递送上具有的潜在开发应用价值。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一系列长链烷基酯胺类脂质化合物。
6.本发明的又一目的是提供长链烷基酯胺类脂质化合物的制备方法。
7.本发明的又一目的是提供一种含有长链烷基酯胺类脂质化合物的组合物。
8.本发明的又一目的是提供长链烷基酯胺类脂质化合物作为脂质分子在核酸递送方面的应用。
9.术语定义在本文中用于本发明描述中的术语仅是为了描述具体实施方案而不作为对本发明的限制。本文所用命名和在本文所述的有机化学、药物化学、生物学中的实验室操作是本领域熟知的和常用的。除非另外提及，本文所用的全部技术和科学术语与本领域所属技术领域的一般技术人员通常所理解的具有相同的含义。
10.如在本发明实施方案和所附权利要求的描述中所用，单数形式的“一”、“一种”、“该”“其
””
用于是指该冠词的单数和复数，除非上下文另外明确提及。例如，一种化合物包括一种或多于一种化合物。
11.如本文所用，“和/或”是指和包括一或多个相关的所列项目的任意和所有可能的组合。
12.如本文所用，术语“疾病”或“病患”是指身体状态或一些器官的任意改变，中断或干扰其功能的实施和/或引起症状。
13.如本文所用，术语“治疗”目的是减轻或消除所针对的疾病状态或病症。如果受试者按照本文所述方法接受了治疗量的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、多晶型物、溶剂合物、同位素标记的化合物、代谢物或前药，或其药物组合物，该受试者一种或多种指征和症状表现出可观察到的和/或可检测出的降低或改善，则受试者被成功地“治疗”了。还应当理解，所述的疾病状态或病症的治疗的不仅包括完全地治疗，还包括未达到完全地治疗，但实现了一些生物学或医学相关的结果。
14.技术主题一本发明提供了具有如式i所示结构的长链烷基酯胺类脂质化合物，或其药用盐：式i其中， x为r1和r2取代的c2-c12的支链或直链烷烃；r1选自c1-c5直链或支链烷基、c2-c5支链或直链烯基、c3-c5环烷基、单卤素取代或多卤素取代的c1-c3烷基或卤素；r2独立的选自c1-c5直链烷基、卤素或h；r1和r2可以键连于相同或不同的碳原子上，当r1和r2键连于相同的碳原子时，r1、r2为独立的取代基，或者r1、r2和它们所键连的碳连接成环。
15.在本发明的一些优选实施方案中，所述r1选自甲基，乙基，异丙基，正丙基，环丙基，卤素，二氟甲基，三氟甲基。
16.在本发明的一些优选实施方案中，所述r2选自甲基，乙基、卤素和h。
17.在本发明的一些优选实施方案中，所述卤素选自f或cl。
18.在本发明的一些优选实施方案中，当r1和r2键连于相同的碳原子时，r1、r2和它们所键连的碳连接成环，优选为三元螺环和四元螺环。
19.在本发明的一些优选实施方案中，所述化合物包括如下结构：在本发明的一些优选实施方案中，所述化合物包括如下结构：
或。
20.技术主题二本发明还提供了式i所示化合物的合成方法。
21.包括以下步骤：。
22.步骤1：向化合物a的质子性溶剂的溶液中，加入oh-x-nh2和diea, 加热反应 12-36小时，加水稀释，乙酸乙酯萃取，纯化得到化合物b；步骤2：向化合物c的非质子性溶剂的溶液中，加入化合物b，碳酸钾，碘化钾，加热反应24-48小时，加水稀释，乙酸乙酯萃取，纯化得到式i化合物。
23.进一步地，所述步骤1的溶剂为乙醇或丙醇。
24.进一步地，所述步骤2的溶剂为2-甲基四氢呋喃和乙腈的混合溶剂，或者环戊基甲醚和乙腈的混合溶剂，2-甲基四氢呋喃或者环戊基甲醚与乙腈的比例为1: 1到3:1。
25.进一步地，所述纯化为经硅胶柱层析纯化。
26.技术主题三本发明提供一种组合物，包括治疗或预防剂和用于递送所述治疗或预防剂的载体，所述载体包括技术主题一所述的长链烷基酯胺类脂质化合物或其药用盐。
27.进一步地，所述治疗或预防剂包括核酸分子、蛋白质、多肽或小分子化合物中的一种或多种。
28.进一步地，所述核酸包括任何形式的核酸分子，包括但不限于单链dna、双链dna、短异构体、agomir、antagomir、反义分子、小干扰rna(sirna)、不对称干扰rna(airna)、microrna(mirna)、双链rna(dsrna)、小发夹rna(shrna)、转移rna(trna)、信使rna(mrna)和本领域已知的其他形式的rna分子，或锁核酸(lna)、肽核酸(pna )和吗啉环寡聚核苷酸等核酸模拟物。
29.进一步地，所述核酸选自至少一种编码抗原的mrna或其片段或表位。
30.进一步地，所述治疗或预防剂为疫苗。
31.进一步地，所述小分子化合物可选自抗肿瘤药、抗感染药、抗抑郁药、抗惊厥药、抗生素/抗菌剂、抗真菌药、抗寄生虫药、免疫调节药或麻醉药。
32.进一步地，“药物组合物”还可以包含其他赋形剂，例如：稀释剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粒化剂、包衣剂、润湿剂、溶剂、共溶剂、助悬剂、乳化剂、增甜剂、调味剂、掩味剂、着色剂、防结块剂、保湿剂、螯合剂、增塑剂、增粘剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂和缓冲剂。
33.本发明化合物及其药学上可接受的盐可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
34.技术主题四本发明还提供了式i所示化合物或其药用盐在制备核酸药物、疫苗、蛋白质或多肽药物、小分子药物中的应用。
35.进一步地，所述应用为在制备核酸递送药物中的应用。
36.进一步地所述应用为在制备mrna药物中的应用。
37.进一步地，所述应用为在制备mrna药物中的应用。
38.进一步地，所述应用为在制备mrna疫苗中的应用。
39.本发明的有益效果如下：本发明提供了一类新的长链烷基酯胺类脂质化合物，通过大量研究以及实验验证，发现该类长链烷基酯胺类脂质化合物具备包封率高，递送效果好、肝毒性低以及相对选择分布的特点，为疾病治疗或预防剂的递送提供了更多的选择基础。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
41.图1为递送的mrna在体内的分布。
具体实施方式
42.以下结合具体实施例阐述本发明，这些实施例不旨在限制本发明的范围，而是为本领域技术人员制备和使用本发明化合物、组合物提供指导。本技术中描述的化合物的化学名称通常从chemdraw ultra(chambridgesoft)和生成/或通常遵循iupac命名法的原理。
43.本实施例部分的化合物的合成路线如下：。
44.实施例1（化合物1）向化合物a（200 mg, 0.43mmol）的乙醇（5ml）溶液中加入4-氨基-1-戊醇（88 mg, 0.85 mmol）和diea (213 μl，1.29 mmol)，加热回流20小时，tlc监测反应，反应完全后冷却至室温。向反应液中加入等体积的水稀释，乙酸乙酯萃取（10ml
×
3），浓缩，硅胶柱层析（二氯甲烷:甲醇 =10:1 ）得到化合物b-1,x=ch3ch(ch2)3（151 mg，收率75%）。
45.向化合物b-1(100 mg，0.21 mmol)的乙腈和环戊基甲醚的混合溶剂（环戊基甲醚: 乙腈 = 2:1，3 ml）中，加入5倍当量的化合物c (367 mg, 1.05 mmol)，k2co3（145 mg, 1.05 mmol）和ki（17 mg, 0.1 mmol），90℃加热反应24小时，tlc监测反应，反应完全后，冷却至室温。向反应液中加入水稀释，乙酸乙酯萃取（10ml
ꢀ×ꢀ
3），浓缩，硅胶柱层析（二氯甲烷 ：甲醇 = 20 : 1 ）得油状化合物1（50 mg， 收率32 %），1h nmr (600 mhz, cdcl3) δ 4.84-4.79 (m, 1h), 4.01-3.99 (t, j = 6.8 hz, 2h), 3.61-3.58 (t, j = 6.2 hz, 2h), 3.26 (brs, 1h), 2.70-2.66 (m, 2h), 2.43 (brs, 2h), 2.30-2.24 (m, 4h), 1.71-1.24 (m, 64h), 1.07 (d, j = 6.2 hz, 3h), 0.85-0.82 (m, 9h);
13
c nmr (126 mhz, cdcl3) δ 173.77, 173.60, 74.23, 67.66, 62.13, 53.26, 53.11, 34.64, 34.17, 34.11, 32.07, 31.94, 31.90, 31.88, 29.63, 29.56, 29.37, 29.29, 29.19, 29.08, 29.02, 28.69, 27.08, 25.97, 25.36, 25.02, 24.81, 24.61, 22.72, 22.70, 15.21, 14.14; ms-esi (m/z): 752 (m+h)
+
。
46.实施例2（化合物2）
cdcl3) δ 173.77, 173.64, 74.15, 70.83, 65.93, 64.52, 54.93, 54.73, 41.68, 34.74, 34.33, 34.24, 31.99, 31.95, 29.68, 29.66, 29.61, 29.58, 29.41, 29.34, 29.32, 29.23, 29.17, 28.74, 27.38, 27.06, 26.48, 26.26, 26.02, 25.40, 25.18, 24.97, 22.76, 22.75, 16.83, 14.18; ms-esi (m/z): 764 (m+h)
+
。
53.实施例9 报告基因荧光素酶mrna的制备1.1质粒线性化报告基因质粒puc57-luc包含t7启动子、5
‘
utr、荧光素酶序列、3’utr以及polya尾，在polya尾最后一个a后面有一个sapi酶切位点。供试质粒 10
µ
g、限制性内切酶sap i (10000u/ml) 1
µ
l、10
×
cutsmart buffer 5
µ
l，用ddh2o补足50
µ
l。限制性内切酶sap i和10
×
cutsmart buffer为配套产品，neb，产品目录号为r0569l。反应条件为37℃，3h。反应完成后，取2
µ
l酶切产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测质粒的线性化情况。确认酶切完成后，利用快速dna产物纯化试剂盒（康维世纪，cw2301m）回收纯化线性化质粒。
54.1.2 体外转录以线性化质粒并作为体外转录的模板，利用高产量t7 rna转录试剂盒进行体外转录。高产量t7 rna转录试剂盒，产品名称为high yield t7 rna synthesis kit，上海兆维科技发展有限公司，产品目录号为on-040；5
×
缓冲液、100mm atp 溶液、100mm ctp 溶液、100mm gtp 溶液、混合酶、dnase i、乙酸铵终止溶液、氯化锂（licl）沉淀剂均为高产量t7 rna转录试剂盒中的组件。100mm ψutp 溶液，全称为n1-me-putp，100mm，上海兆维科技发展有限公司，产品目录号为r5-027。
55.体外转录的具体步骤：首先，制备反应体系，混匀后37℃反应3h；然后，加入1
µ
l dnase i（含量为1u），37℃反应15min；然后加入15
µ
l 乙酸铵终止溶液。
56.反应体系：5
×
缓冲液 4
µ
l、100mm atp 溶液 2
µ
l、100mm ψutp 溶液 1
µ
l、100mm ctp 溶液 2
µ
l、100mm gtp 溶液 2
µ
l、混合酶 2
µ
l、线性化质粒（dna含量为500ng-1
µ
g），无核酸酶水补齐至20
µ
l。
57.1.3 rna纯化向体外转录反应体系中加入1/3体积的7.5 m licl（使其终浓度为2.5m），-20℃放置30 min。12000 g离心15 min，rna沉淀在底部，弃掉上清。加入1 ml 70%乙醇清洗rna，12000 g离心5 min，弃掉上清。晾干后加入50
ꢀµ
l无rna酶的水溶解沉淀，并使用紫外分光光度计进行mrna定量，得到加帽的体外转录mrna。
58.实施例10 mrna-lnp包载将mrna原液分散于20 mm醋酸溶液（ph 5.0）中，使终浓度为200
ꢀµ
g/ml（水相）。按照实施例化合物∶胆固醇∶dspc∶dmg-peg2000 = 50∶38.5∶10∶1.5的摩尔比进行混合成混脂（油相）。控制水相和油相流速通过t混流的方式，使mrna与脂质混合物按3∶1的体积比进行混合，得到lnp包载的mrna。用缓冲液将包载好的lnp稀释10倍，然后通过超滤进行浓缩，并置换稀释液，最终将lnp浓缩到mrna到200
µ
g/ml，同时lnp的ph调节到7-8左右。最后用ribogreen试剂盒和10% otg作为破乳剂检测lnp中mrna总含量和游离含量，并计算lnp的包封率。在用稀释液将lnp最终产品稀释10倍，加入到粒径池中1ml，放到马尔文zetasizer仪器上，检测lnp的粒径和pdi，结果见表1。
59.表1：实施例化合物的lnp的表征数据
编号粒径（nm）pdi包封率实施例194.20.230354.55%实施例272.260.110297.55%实施例398.20.183657.14%实施例498.410.252257.25%实施例578.070.233781.12%实施例668.870.14989.94%实施例768.310.14588.12%实施例895.70.36860.43%实施例11 小鼠体内报告基因表达检测取制备的lnp包载的mrna溶液，用pbs缓冲液稀释，得到注射用液。20g左右的balb/c雌性小鼠，用胰岛素注射器在小鼠股四头肌部位注射注射用液，每只小鼠注射50
µ
l。设计两种剂量：一种剂量为“每50
µ
l注射用液含5
µ
g mrna”，另一种剂量为“每50
µ
l注射用液含14
µ
g mrna”。20g左右的balb/c雌性小鼠，用胰岛素注射器在小鼠股四头肌部位注射pbs缓冲液，每只小鼠注射50
µ
l。
60.小鼠注射24h后，用perkinelmer的ivis检测荧光素酶的体内表达情况。底物为d-荧光素钠盐 (goldbio, lucna-1g)，用生理盐水配成15 mg/ml的浓度，用0.22
µ
m滤膜过滤除菌，分装避光保存于-20℃。成像前每只20g左右的小鼠腹腔注射200
µ
l底物溶液，作用10-20min，然后使用异氟烷气体麻醉后将小鼠趴在成像板上检测动物活体的荧光，结果见表2。
61.表2：阳离子脂lnp递送荧光素酶mrna小鼠体内表达水平
编号平均荧光强度（p /s/cm2/sr）标准差实施例11.17e+034.42e+02实施例23.74e+053.95e+05实施例37.37e+033.05e+03实施例41.39e+035.55e+02实施例53.62e+032.16e+03实施例62.78e+051.37e+05实施例71.91e+034.15e+02实施例81.57e+036.41e+02
实施例12 脂质急性毒性分析为了考察实施例化合物的生物安全性，我们分析了化合物2和6的急性毒性。试验入组balb/c雌性小鼠，每组10只，每组分别设置高低剂量组分别为50
µ
g/只和150
µ
g lnp/只。小鼠注射24h后，通过眼眶采血，将大约100
µ
l的血液采集到含有edta的采血管中，取样后上下轻轻颠倒几次使血液与抗凝剂充分混匀。4℃保存，不可与冰袋直接接触，不可猛烈撞击，试验结果见表3和表4。
62.表3：阳离子脂lnp急性毒性分析（低剂量组）
ave(sd)天门冬氨酸氨基转移酶u/l丙氨酸氨基转移酶u/l碱性磷酸酶（alp）u/lγ-谷氨酰基转移酶（ggt）u/l总胆红素（tbil）（mmol/l)肌酐（umol/l）实施例2107.55 (8.14)35.44 (3.67)115.29 (11.87)0.24(0.37)1.21 (0.19)14.2 (4.79)实施例6110.27 (10.05)36.19 (3.01)111.74(12.88)0.38 (0.41)1.18 (0.23)13.5 (2.06)pbs98.32 (5.62)34.04 (4.58)168.58 (19.1)0.14 (0.05)1.43 (0.12)17.4 (2.87) 表4：阳离子脂lnp急性毒性分析（高剂量组）
ave(sd)天门冬氨酸氨基转移酶u/l丙氨酸氨基转移酶u/l碱性磷酸酶（alp）u/lγ-谷氨酰基转移酶（ggt）u/l总胆红素（tbil）（mmol/l)肌酐（umol/l）实施例2128.26 (3.23)37.25 (2.97)116.9 (14.11)0.18 (0.15)1.43 (0.22)12.1 (0.77)实施例6126.77 (12.46)39.99 (3.47)109.84(7.25)0.18 (0.18)1.34 (0.21)12.4 (1.27)pbs108.50 (18.66)39.60 (3.05)173.92 (19.66)0.16 (0.05)1.15 (0.13)27.4 (22.84)
结果显示，与对照组相比，各组的肌酐、总胆红素、天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶六个主要毒理指标均无显著性变化，初步说明本发明所提供的化合物的安全性。
63.实施例13 体内表达分布分析为了考察脂质递送mrna在体内的分布特点，我们分析了实施例化合物2和6包载报告基因荧光素酶mrna的单次肌肉注射给予c57bl/6j小鼠的分布特征。试验入组c57bl/6j小鼠10只，雌雄各半，每只给药 50
ꢀµ
g。
64.阴性对照组动物于给药后2h和336h，供试品组分别于给药后2h、6h、24h、48h、72h、120h、168h、336h收集全血、骨髓、肝、脾、心、肾、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、脾、脑、胃、小肠、非注射部位肌肉、注射部位肌肉组织等。采用rt-pcr法检测各时间点样本中的rna含量，方法的定量下限为40 copies/反应，以反映在c57bl/6j小鼠体内的分布特征。
65.结果显示在化合物2注射的动物中，在组织脏器中暴露量由高到低依次为：腹股沟淋巴结、注射部位肌肉、非注射部位肌肉、全血、脾、骨髓、肠系膜淋巴结、心、肝、肾、小肠、胃和脑。在化合物6注射的动物中，在组织脏器中暴露量由高到低依次为：腹股沟淋巴结、注射部位肌肉、非注射部位肌肉、全血、脾、骨髓、肠系膜淋巴结、心、肝、肾、胃、小肠和脑（见图1）。需要指出的是，化合物2递送的mrna在小肠中水平相对较高，而化合物6化合物递送的mrna在胃的分布相对较高。这一结果提示，该化合物2和6在药物递送中具有一定的肠胃系统选择性，更适于作为小肠和胃部的药物递送载体。