一种铜绿假单胞菌的选择性增菌培养基及制备方法与流程

本发明涉及食源性致病菌的检测，尤其设计铜绿假单胞菌的选择性增菌鉴别培养基及其制备方法。

背景技术：

1、食品安全问题是全社会共同关注的问题。近年来，食品安全问题频发，全世界各行各业都在随时随地上演着不可预知的由微生物导致的食源性疾病的爆发。作为人类生命之源的水行业，对于大肠菌群、铜绿假单胞菌、粪链球菌等更是有着严格的国家标准检测限值。其中铜绿假单胞菌（ p. aeruginosa），又称绿脓杆菌，是一种人兽共患性常见致病菌，广泛存在于土壤、水和空气以及人的皮肤、肠道、呼吸道中，属于机会性致病菌，其所产生的各种内毒素、致死性外毒素能广泛侵袭机体各个脏器、组织，引起各种病变和炎症。在2014年，gb 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》，首次将铜绿假单胞菌纳入了食品检验的范围，明确指出铜绿假单胞菌不得检出。

2、目前对于铜绿假单胞菌检测方法主要有cn琼脂、金氏b培养基、乙酰胺液体培养基等常规国标培养与鉴定方法，大多要耗费4-6天时间，且所用试剂繁多，操作步骤复杂，费时费力且检出效率低下。近年来，基因检测技术应用广泛，该技术检测精准度很高，但需要专业人士的操作，而目前在食品安全管理方面还没有健全的制度体系保证操作人员的专业性；pcr检测方法也存在着操作复杂、需要预处理及假阳性等缺点；分子生物学方法、蛋白免疫方法等几大类仪器分析检测手段几乎都已经可以实现各类样品的定性检验，但是以质谱色谱技术为基础的检验技术仪器成本相对较高，生物传感器类检验方法在灵敏度方面略显不足，要满足这类仪器的检测灵敏度仍然需要前增菌或者选择性增菌处理，不能达到一步检测致病菌的效果。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提出了一种铜绿假单胞菌的选择性鉴别增菌培养基及其制备方法。本发明的培养基能够在对目标菌进行增菌的同时抑制非目标菌的生长，且该发明的培养基制备方法简单，培养与检测铜绿假单胞菌的操作简单，特异性好，灵敏度高。

2、本发明的具体技术方案为：一种铜绿假单胞菌的选择性增菌鉴别培养基及制备方法，按重量份数计包括如下组分：

3、蛋白胨7-15份，甘露醇2-3份，磷酸二氢钾1-2份，磷酸氢二钠3-4份，牛胆粉2-3份，萘啶酮酸溶液0.8-1.2份，检测β-丙氨酰氨肽酶酶活性的物质0.07-0.08份，去离子水或超纯水1000份;所述萘啶酮酸溶液由0.01-0.03份萘啶酮酸和1000份灭菌蒸馏水组成。

4、在本发明中，以铜绿假单胞菌为目标菌，蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠作为基础培养基为细菌提供碳源、氮源、无机盐等，甘露醇作为促进剂，能够促进细菌生长；牛胆粉、萘啶酮酸作为抑制剂，抑制除目标菌以外的各种细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等等。

5、作为优选，按重量份数计，所述选择性培养基的组分为：

6、蛋白胨10份，甘露醇3份，磷酸二氢钾1份，磷酸氢二钠3份，牛胆粉3份，萘啶酮酸1份，检测β-丙氨酰氨肽酶酶活性的物质0.08份，去离子水或超纯水1000份。

7、一种铜绿假单胞菌选择性增菌鉴别培养基的制备方法，包括如下步骤：

8、萘啶酮酸溶液的配制：称取萘啶酮酸0.01份加入到1000份灭菌蒸馏水中，得到萘啶酮酸溶液并备用；

9、称取蛋白胨7-15份，甘露醇2-3份，磷酸二氢钾1-2份，磷酸氢二钠3-4份，牛胆粉2-3份，检测β-丙氨酰氨肽酶酶活性的物质0.07-0.08份，先后加入到1000份离子水或超纯水中，混合均匀后用1mol/l的氢氧化钠溶液和1mol/l的盐酸溶液将所得混合物ph调节至7.5，121℃高压灭菌15min后值得半成品培养基。

10、然后等待半成品培养基冷却至室温，在无菌条件下，向混合物中添加萘啶酮酸1份，混合均匀后制得成品培养基，在无菌环境下加入待检测样品后放入37℃恒温培养箱培养24-48h观察其荧光检出情况即可。

11、与现有技术对比，本发明的增菌与鉴定方法操作简单，特异性好，灵敏度高。

技术特征：

1.一种铜绿假单胞菌的选择性增菌鉴别培养基，其特征在于按重量份数计包括如下组分：

2.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌选择性增菌鉴别培养基，其特征在于按重量份数计，所述选择性培养基的组分为：

3.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌选择性增菌鉴别培养基，其特征在于通过检测β-丙氨酰氨肽酶的酶活性以检测铜绿假单胞菌。

4.如权利要求1所述的检测β-丙氨酰氨肽酶酶活性的物质为l-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐。

5.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌选择性增菌鉴别培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

6.权利要求1-5中的任一项成分用于分离和鉴定铜绿假单胞菌的体外用途。

技术总结
本发明涉及用于铜绿假单胞菌的选择性增菌培养基，包括：蛋白胨，甘露醇，磷酸二氢钾，磷酸氢二钠，牛胆粉，萘啶酮酸，能够检测β‑丙氨酰氨肽酶酶活性的荧光探针等成分。本发明还涉及这种培养基用于分离和鉴定铜绿假单胞菌。最后，本发明涉及用于鉴定铜绿假单胞菌的方法，根据这种方法，检测β‑丙氨酰氨肽酶酶活性以检测铜绿假单胞菌。本发明的培养基能够对目标菌进行增菌并抑制非目标菌，而且本发明的培养基制备方法操作简单，特异性好，准确率高。

技术研发人员：崔倩,张羽诺,杨辉,王嘉文,肖云祥,王可陵
受保护的技术使用者：海南微氪生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/19