用于提高三角褐指藻中岩藻黄质产量的培养基及培养方法

1.本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种用于提高三角褐指藻中岩藻黄质产量的培养基及培养方法。


背景技术：

2.岩藻黄质(fucoxanthin，fx)，又名岩藻黄素或褐藻黄素，呈红褐色，含有一个丙二烯骨架，属于类胡萝卜素的含氧衍生物，常见于褐藻和硅藻中。岩藻黄质是一种天然活性物质，它已被证明是一种安全有效的膳食补充剂，具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗肥胖、抗糖尿病的作用，且不会对神经系统造成影响。尽管岩藻黄质是一类利用价值非常高的天然色素，但是由于其种质资源匮乏，提取效率低且难以通过化学手段合成，极大的限制了岩藻黄质的应用。
3.三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)属于硅藻的一种，属于硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻属。三角褐指藻不含内毒素，培养简单，成本低廉，生长速度快。但岩藻黄质在三角褐指藻中的含量不高。目前，一般采用物理、化学诱变和基因工程育种等手段改变三角褐指藻的遗传信息，从而提高三角褐指藻中岩藻黄质的产量。但是这种方法前期投入多，研发成本高且研发周期长。因此，急需一种操作简单、成本低、生产周期短的方法来提高三角褐指藻中岩藻黄质产量。
4.5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ala)具有类似植物激素的生理活性，是作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化农药，也是植物生长调节剂的一种，在农业领域应用广泛。6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-bap)是一种植物生长调节剂，也是迄今为止人工合成细胞分裂素中较成功的一个。它能够促进细胞分裂，利于细胞生长。将这两种激素创造性的添加到三角褐指藻培养基中，能显著促进三角褐指藻中岩藻黄质相关基因的表达，从而提高岩藻黄质的产量。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的是提供了一种通过添加外源性植物激素提高三角褐指藻中岩藻黄质产量的培养基。本发明进一步提供了一种提高三角褐指藻中岩藻黄质产量的培养方法，具体为在三角褐指藻达到指数生长期时，添加外源性植物激素，促进三角褐指藻的生长，提高岩藻黄质的积累速度和产量。
6.技术方案：本发明所述的一种用于培养三角褐指藻的培养基，所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有0～3mg/l的6-苄基氨基嘌呤；或者所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有0～3mg/l的5-氨基乙酰丙酸；或者所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有0～3mg/l的6-苄基氨基嘌呤以及0～3mg/l的5-氨基乙酰丙酸。
7.本发明在三角褐指藻培养过程中添加了外源性植物激素，并确定添加5-氨基乙酰丙酸和6-苄基氨基嘌呤中的一种或两种，三角褐指藻的生长速度和岩藻黄质的产量大幅提升。
8.作为本发明的一种优选实施方式，所述f/2培养基含有以下组分：硝酸钠75-100mg/l、磷酸二氢钠0.5-1mg/l、维生素b
12 0.5-1μg/l、生物素0.5-1μg/l、盐酸硫胺素100-200μg/l、偏硅酸钠10-20mg/l以及f/2微量元素(f/2metals)1ml/l，其余为海水。
9.作为本发明的一种优选实施方式，所述f/2metals包括以下组分：4.4g/l edtana2·
2h2o、3.16g/l fecl3·
6h2o、0.012g/l coso4·
7h2o、0.021g/l znso4·
7h2o、0.18g/l mncl2·
4h2o、0.007g/l cuso4·
5h2o、0.007g/l namoo4·
2h2o，余量为水。
10.作为本发明的一种优选实施方式，所述f/2培养基(海水)的配方如下：nano3:75mg/l，nah2po4·
h2o:0.6mg/l，维生素b
12
(vitamin b12):0.5μg/l，生物素(biotin):0.5μg/l，盐酸硫胺素(thiamine hcl):100μg/l，na2sio3·
9h2o:10mg/l，f/2微量元素(f/2metals):1ml/l。
11.作为本发明的一种优选实施方式，所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有0.8～1.2mg/l的6-苄基氨基嘌呤；或者所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有0.8～1.2mg/l的5-氨基乙酰丙酸；或者所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有0.8～1.2mg/l的6-苄基氨基嘌呤以及0.8～1.2mg/l的5-氨基乙酰丙酸。
12.作为本发明的一种优选实施方式，所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有1.0mg/l的6-苄基氨基嘌呤；或者所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有1.0mg/l的5-氨基乙酰丙酸；或者所述培养基为f/2培养基，所述f/2培养基中含有1.0mg/l的6-苄基氨基嘌呤以及1.0mg/l的5-氨基乙酰丙酸。
13.本发明进一步提供了一种添加植物激素提高三角褐指藻中岩藻黄质产量的方法，所述方法为在三角褐指藻到达指数培养期时添加外源性植物激素，采用的培养基为f/2培养基；所述外源性植物激素为6-苄基氨基嘌呤、5-氨基乙酰丙酸或者6-苄基氨基嘌呤和5-氨基乙酰丙酸的组合。
14.作为本发明的一种优选实施方式，所述5-氨基乙酰丙酸的添加量为0～3mg/l；所述6-苄基氨基嘌呤的添加量为0～3mg/l。
15.作为本发明的一种优选实施方式，所述f/2培养中添加1.0mg/l的5-氨基乙酰丙酸以及1.0mg/l的6-苄基氨基嘌呤。
16.作为本发明的一种优选实施方式，所述三角褐指藻的培养方法，包括以下步骤：
17.(1)制备藻液，培养三角褐指藻细胞数达到指数生长期；
18.(2)按照10％-20％的体积接种至海水培养基；
19.(3)添加外源性植物激素进行光照充气培养。
20.作为本发明的一种优选实施方式，所述的培养方法为：到达生长期前，所述三角褐指藻培养条件为光照强度155-2000lux，光暗比为16-20h:4-8h，培养温度20-25℃，直至生长密度达到1
×
10
7-2
×
107个/ml。
21.作为本发明的一种优选实施方式，所述的培养方法为：添加外源性植物激素后，所述三角褐指藻培养条件为光照强度5000-5500lux，光暗比16-20h:4-8h，培养温度20-25℃。
22.作为本发明的一种优选实施方式，所述外源性植物激素在f/2培养基中添加最终浓度为0-3mg/l的6-苄基氨基嘌呤和最终浓度为0-3mg/l的5-氨基乙酰丙酸。
23.作为本发明的一种优选实施方式，所述外源性植物激素在f/2培养基中添加最终浓度为1.0mg/l的6-苄基氨基嘌呤和最终浓度为1.0mg/l的5-氨基乙酰丙酸。
24.有益效果：(1)本发明在三角褐指藻到达指数培养期时添加外源性植物激素6-bap、5-ala或者是6-bap和5-ala的混合激素，可大幅提高三角褐指藻的生长；(2)本发明在三角褐指藻到达指数培养期时添加6-bap和5-ala的混合激素，提高了岩藻黄质的积累速度；(3)本发明通过在三角褐指藻的培养过程中添加6-bap或者是6-bap与5-ala的混合激素，可诱导岩藻黄质相关基因表达，本发明添加6-bap与5-ala的混合激素，可以将zep2的转录水平提高8.74倍；(4)本发明在培养过程中无需额外设备，具有操作简单、成本低、生产周期短等特点，可提高三角褐指藻中岩藻黄质产量，实现岩藻黄质大规模应用。
附图说明
25.图1为不同激素的添加对于三角褐指藻以及岩藻黄质的影响；其中，a图为6-bap组、5-ala组、两者混合激素组以及空白对照组对三角褐指藻x1生长的影响；b图为6-bap组、5-ala组、两者混合激素组以及空白对照组对三角褐指藻x1中fx积累和生长的影响。
26.图2为不同激素添加对于与形成fx关键酶相关基因表达量的影响，其中，a图为6-bap组对三角褐指藻x1形成fx的关键酶的影响；b图为两者混合激素组对三角褐指藻x1形成fx的关键酶的影响；c图为5-ala组对三角褐指藻x1形成fx的关键酶的影响，图2中的粗体表示转录水平的变化。
具体实施方式
27.为使得本发明实施例的技术方案和优点更加清晰，以下结合本发明实施例进行详细描述。
28.下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
29.下列实施例中所使用的实验方法、实验所需试剂等，如无特殊说明，均为常规操作。
30.实施例1：三角褐指藻的培养
31.三角褐指藻x1菌株是从青岛沿海水域分离，保存在液氮中。活化的x1菌株在f/2培养基中作为种子培养。其f/2培养基配方为：nano3:75mg/l,nah2po4
·
h2o:0.6mg/l,维生素b
12
(vitamin b
12
):0.5μg/l,生物素(biotin):0.5μg/l,盐酸硫胺素(thiamine hcl):100μg/l,na2sio3·
9h2o:10mg/l，f/2metals:1ml。f/2metals(edtana2·
2h2o:4.4g/l,fecl3·
6h2o:3.16g/l,coso4·
7h2o:0.012g/l,znso4·
7h2o:0.021g/l,mncl2·
4h2o:0.18g/l,cuso4·
5h2o:0.007g/l,namoo4·
2h2o:0.007g/l,dh2o)。
32.在温度为23℃，光暗比为16h:8h，光强度为2000lux的条件下培养，培养至细胞密度为1.5
×
107个/ml。然后将种子转移到500ml的烧瓶中，装300ml f/2培养基，在相同的温度下进行三角褐指藻的培养来生产岩藻黄质，其光暗比为16h:8h，光强为5500lux。种子培养后立即用不同植物激素(包括褪黑素、4-氨基丁酸、6-bap以及5-ala)进行预实验，观察三角褐指藻的生长状态，然后选取生长效果较好的激素进行下一步实验。三角褐指藻对照组培养条件与实验组的区别是不添加任何植物激素。
33.实施例2：添加植物激素培养三角褐指藻x1
34.2.1预实验完毕，选取6-bap和5-ala进行进一步实验，通过浓度梯度的激素添加，
最终确定1.0mg/l为最佳浓度。将三角褐指藻x1培养到细胞密度为1.5
×
107作为种子液，之后进行传代培养，设置三个实验组和对照组，实验组分别为在培养基中添加1.0mg/l 6-bap、1.0mg/l 5-ala以及1.0mg/l 6-bap和1.0mg/l 5-ala两者混合激素，培养10d，每天进行取样进行数据测定。
35.2.2实验方法：对三角褐指藻x1进行连续取样测定
36.(1)测定三角褐指藻生长过程中生物量的变化：取40ml藻液，8000rpm离心8min，弃上清将藻泥放在烘箱(85℃)中干燥过夜，然后称其干藻细胞的干重。
37.生物量＝m/v(g/l)
38.(2)测定三角褐指藻生长过程中岩藻黄质含量的变化：对达到生长指数期的三角褐指藻进行传代培养，并分别加入添加6-bap和5-ala，以及两者混合激素，在合适条件下培养10d，进行取样；以及将含有6-bap和5-ala，以及两者混合激素实验组和不含植物激素对照组进行不同时间段的取样。
39.取50ml藻液于8000
×
g离心后冷冻干燥处理。用ultra-turrax tube drive用10ml乙醇提取生物质。上清经离心，用旋转真空浓缩器在65℃下浓缩至4ml。岩藻黄质溶液使用0.22μm滤膜过滤，并在高效液相色谱(hplc)系统中运行。色谱柱为c18，流动相为乙腈：超纯水＝85：15(v:v)。每个样品的进样体积为10μl，并记录具体数据进行分析。
40.(3)岩藻黄质标准曲线的制作：取不同质量的岩藻黄质标准品用无水乙醇进行稀释配制成1.8μg/ml，2.2μg/ml，2.7μg/ml，3.7μg/ml，5.5μg/ml，11μg/ml，22μg/ml不同浓度，然后在高效液相色谱(hplc)系统中运行，以峰面积为纵坐标，岩藻黄质浓度为横坐标，绘制标准曲线并按照标准曲线计算样品中岩藻黄质的浓度。
41.2.3实验结果
42.结果如图1所示，在培养中分别加入6-bap和5-ala以及两者混合激素，可以看出加入两者混合激素效果最佳。由图1中的a图得出，单独加入6-bap或者是单独加入5-ala，三角褐指藻的生物量从2d到培养4d增长量最多，6-bap实验组4d可达生物量增加到0.57g/l，5-ala实验组4d可达生物量增加到0.54g/l。相应的图1中b图可以看出，岩藻黄质产量为17.20mg/l，几乎是对照的1.6倍。而加入两者混合激素从培养2d到培养4d增长量最多，4d可达生物量增加到0.62g/l。相应的岩藻黄质产量为19.63mg/l，几乎是对照的2倍。结果表明，6-bap能显著促进生长和岩藻黄质积累。如图1所示，前4d，单独加入6-bap或者是单独加入5-ala的两个实验组的岩藻黄质积累显著，从第6天到第10天，累积速率迅速减慢。而混合激素实验组在整个培养过程中生物量稳定增长，并且随着第5天后，积累的速度呈增加的趋势，而单独添加激素的实验组，岩藻黄质的积累速度开始降低，从图1的实验结果可以看出，本发明通过混合激素的添加可以增加岩藻黄质的积累速度。
43.实施例3：转录组分析
44.将三角褐指藻x1在含或不含6-bap以及两者混合激素的f/2培养基中培养4d，离心收集细胞。用trizol试剂提取总rna，反转录成cdna。将cdna发送到转录组测序。
45.根据dxs、psy、pds1、pds2、zds、lcyb、zep1、zep2、zep3、vde、fcpb的编码序列，设计引物进行qrt-pcr(所用试剂盒为rna提取试剂盒、反转录试剂盒以及实时荧光定量试剂盒，来源于宝日医生物技术(北京)有限公司)。选择编码β-肌动蛋白的基因作为内参。采用sybr pcr主混合进行3个重复的qrt-pcr。通过ct值分析基因在含植物激素培养基中相对转录水
平的变化。以原始f/2培养基培养的样品为对照。
46.引物序列5
’‑
3：
47.dxs 5’：agccaattctggactcggtg，dxs 3’：gcaaggcaacagtgagttcg；psy 5’：ccacgccgaacatgctttag，psy 3’：gacttcttgcacttgtgccg；
48.pds1 5’：ttctccacgacactcaaggc，pds1 3’：ccggtttcgatccagtctcc；
49.pds2 5’：gtgttctcggtggcagtctt，pds2 3’：gagccgacgctagagaagtc；
50.zds 5’：ttggactcgatggaaggtgc，zds 3’：ccgctttcctctttcgcttg；
51.lcyb 5’：gcattgcgacgtacatggtc，lcyb 3’：tcgtcgagcttcactcttgg；
52.zep1 5’：ggcactcgaacgcatcaatc，zep1 3’：tcgaagcgtaccaaccagtc；
53.zep2 5’：atacaccgtctttgcgggag，zep2 3’：ccatcaccgacatcactcgt；
54.vde 5’：ttccatcaaggcgcaaaagc，vde 3’：gctgggaggtttctcgttca；
55.fcpb 5’：agcaccgcttggattctacg，fcpb 3’：tgccaagtatccagcaacgg；
56.β-actin5’：gactccaccttccagaccatta，β-actin3’：gaccctccaatccaaacagag；
57.its 5’：tccgtaggtgaacctgcgg，its 3’：tcctccgcttattgatatgc。
58.结果如图2所示，如图2中a图所示，在6-bap组中，dxs和psy的转录水平分别是对照组的1.07倍和6.80倍，而在两者混合激素组，dxs和psy的转录水平分别是对照组的1.76倍和7.68倍，表明两者混合激素组诱导了更多的碳通量转向色素的形成，特别是类胡萝卜素的生物合成。岩藻黄质形成步骤中的其他基因也普遍上调。如图2中b图所示，添加两者混合激素后，zep1、zep2和zep3的转录水平均显著上调。在这些基因中，zep2对其响应最为敏感。在两者混合激素组中，zep2的转录水平提高了8.74倍。如图2中c图所示，在5-ala组中，zep1、zep2和zep3的转录水平也是普遍上调。从图2的结果可以看出，与岩藻黄质生物合成途径有关的基因表达上调，表明在三角褐指藻培养中加入5-ala和6-bap能明显促进岩藻黄质的积累。
59.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而并非对发明进行限定。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的范围的情况下，能利用上述公开的技术内容对本发明的技术方案进行多种可能的变更和改，或改为等效变更的等效实施例，仍属于本发明技术方案的保护范围。