一种极速基因合成方法与流程

1.本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种极速基因合成方法。


背景技术：

2.基因合成是指在体外人工合成双链dna分子的技术，与寡核苷酸(oligo)的合成有所不同，寡核苷酸是单链的，所能合成的最长片段仅为100nt左右，而基因合成则为双链dna分子合成，所能合成的长度范围为50bp-12kb。现有行业内小于1k的基因从头合成，需要先合成数个100-150个核苷酸长度的序列，虽然更长的片段(300-600nt)也可以直接合成，但是dna的人工合成随着长度的延长，合成产率会急剧降低，所以有需求的客户一般委托相关企业合成所需片段。
3.企业提供的基因合成服务一般包括引物合成、片段拼接、转化克隆、qc验证，最终向客户进行产品交付，长片段基因合成全过程一般需要4-9天。客户为了科研进度需要尽快拿到合成的产品，所以提供服务的企业需要不断提高基因合成的效率，因此提出一种极速基因合成方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种极速基因合成方法，以解决背景技术中的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种极速基因合成方法，包括如下步骤：
7.通过dnaworks程序设计寡核苷酸序列，然后合成寡核苷酸，通过重叠延伸pcr技术组装这些寡核苷酸，再加入引物和聚合酶等进行第二轮pcr，对最终的pcr产物进行分析和纯化，得到纯化的dna片段，将纯化后的dna片段克隆进puc19载体，转化大肠杆菌后挑选单克隆菌落并进行菌落pcr，抽提质粒进行测序验证；将质粒纯化，然后将纯化后的质粒采用基因测序技术对克隆产物进行验证，对比是否有突变、snps、插入或缺失，进行qc酶切验证后完成基因合成。
8.进一步地，聚合酶为taq dna聚合酶的dna合成活性结构域、t4 dna连接酶连接活性结构域和thermus aquaticus连接酶的连接活性结构域通过柔性linker线性连接形成的融合蛋白。
9.进一步地，柔性linker的氨基酸序列为ggggsggggsggggs。
10.进一步地，该聚合酶的氨基酸序列如seq id no：1所示，具体如下：
11.[0012][0013]
进一步地，改良型大肠杆菌通过如下步骤制备：
[0014]
步骤s1、制备质粒：
[0015]
1、pam1：设计8条mix引物扩增后重组到ptarget-f(bmahi-ecori)；
[0016]
2、pam2：设计8条mix引物扩增后重组到ptarget-f(bmahi-ecori)；
[0017]
3、pdonor1(ko700bp)：设计18条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0018]
4、pdonor2(ko3.4bp)：设计18条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0019]
5、pdonor3(ko700bp+ki cl-700bp)：设计34条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0020]
6、pdonor1(ko3.4bp+ki cl-700bp)：设计36条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0021]
步骤s2、用含pcas质粒的dh10b大肠杆菌进行电转化：
[0022]
1、在30℃的条件下挑斑摇lb单管过夜，然后从单管中取出1ml种子液加入含有150ml lb培养基的500ml锥形瓶中，添加150μl诱导剂，在30℃的条件下培养5h，测od600至0.6；
[0023]
2、将150ml上一步获得的菌液均分转移到3个50ml的离心管中，准备2个冰盒，其中一个放置浓度为10％的甘油和ddh2o，另一个放置电机杯和离心管；将离心管在4℃和
4000r/min的条件下离心10min，去除上清，然后用ddh2o重悬细胞，混匀后在4℃和4000r/min的条件下离心10min，再次去除上清；加入1ml浓度为10％的甘油重悬细胞，取出冰浴的1.5ml ep管并分别装入100μl重悬液，即准备好的dh10b电转感受态细胞，冰浴放置备用；
[0024]
3、准备4组需要转化的产物，组1含有pam1 4μl、pdonor1 1μl，组2含有pam1 4μl、pam2 4μl、pdonor2 1μl，组3含有pam1 4μl、pdonor3 1μl，组4含有pam1 4μl、pam2 4μl、pdonor4 1μl；
[0025]
4、取出4个dh10b电转感受态细胞，分别将4组需要转化的产物加到单独的dh10b电转感受态细胞中，采用2mm规格的电机杯分别进行电转化，然后置于30℃摇床中孵育1h，离心涂板，30℃培养箱中过夜培养；
[0026]
步骤s3、向菌体中敲入氯霉素抗性基因(sbcc)，利用涂有氯霉素的平板培养，观察是否长斑；
[0027]
步骤s4、验证试验：
[0028]
采用巢式pcr验证菌体基因组是否得到编辑；将验证后的菌体通过摇含iptg的培养基以去除ptarget-f质粒和摇37℃以去除pcas质粒，得到改良型大肠杆菌。
[0029]
本发明的有益效果：
[0030]
本发明的基因合成方法在片段连接和转化克隆的工艺流程上进行优化，转化克隆过程所采用的改良型大肠杆菌生长快，质粒表达拷贝数较未改造的常规菌株提高了2倍，提纯后基因合成的产量随之增加；所采用的聚合酶为taq dna聚合酶的dna合成活性结构域、t4 dna连接酶连接活性结构域和thermus aquaticus连接酶的连接活性结构域通过柔性linker线性连接形成的融合蛋白，t4 dna连接酶为常温连接酶，thermus aquaticus连接酶为高温连接酶，合成的聚合酶具有dna合成活性、常温和高温条件下小片段连接活性，该聚合酶活性高且对工作环境的适应性好，反应过程中连接dna片段的成功率更高，有利于降低重组错配率，从而提高了大片段dna的合成效率，缩短了基因合成的时间，便于尽快向客户交付产品。
具体实施方式
[0031]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例1
[0033]
制备改良型大肠杆菌，包括如下步骤：
[0034]
步骤s1、制备质粒：
[0035]
1、pam1：设计8条mix引物扩增后重组到ptarget-f(bmahi-ecori)；
[0036]
2、pam2：设计8条mix引物扩增后重组到ptarget-f(bmahi-ecori)；
[0037]
3、pdonor1(ko700bp)：设计18条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0038]
4、pdonor2(ko3.4bp)：设计18条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0039]
5、pdonor3(ko700bp+ki cl-700bp)：设计34条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0040]
6、pdonor1(ko3.4bp+ki cl-700bp)：设计36条mix引物扩增后连平端到pbf(ecorv)中；
[0041]
步骤s2、用含pcas质粒的dh10b大肠杆菌进行电转化：
[0042]
1、在30℃的条件下挑斑摇lb单管过夜，然后从单管中取出1ml种子液加入含有150ml lb培养基的500ml锥形瓶中，添加150μl诱导剂，在30℃的条件下培养5h，测od600至0.6；
[0043]
2、将150ml上一步获得的菌液均分转移到3个50ml的离心管中，准备2个冰盒，其中一个放置浓度为10％的甘油和ddh2o，另一个放置电机杯和离心管；将离心管在4℃和4000r/min的条件下离心10min，去除上清，然后用ddh2o重悬细胞，混匀后在4℃和4000r/min的条件下离心10min，再次去除上清；加入1ml浓度为10％的甘油重悬细胞，取出冰浴的1.5ml ep管并分别装入100μl重悬液，即准备好的dh10b电转感受态细胞，冰浴放置备用；
[0044]
3、准备4组需要转化的产物，组1含有pam1 4μl、pdonor1 1μl，组2含有pam1 4μl、pam2 4μl、pdonor2 1μl，组3含有pam1 4μl、pdonor3 1μl，组4含有pam1 4μl、pam2 4μl、pdonor4 1μl；
[0045]
4、取出4个dh10b电转感受态细胞，分别将4组需要转化的产物加到单独的dh10b电转感受态细胞中，采用2mm规格的电机杯分别进行电转化，然后置于30℃摇床中孵育1h，离心涂板，30℃培养箱中过夜培养；
[0046]
步骤s3、向菌体中敲入氯霉素抗性基因(sbcc)，利用涂有氯霉素的平板培养，观察发现平板长斑，表明氯霉素抗性基因成功敲入基因组中并且能够成功表达；
[0047]
步骤s4、验证试验：
[0048]
采用巢式pcr验证菌体基因组是否得到编辑，组1-组4的巢式pcr菌检过程如下：
[0049]
组1：一轮pcr：ge-a-jjf/ge-b-jjr 700bp，二轮pcr:ge-ca-jjf/ge-cb-jjr 600bp；空载体：1100bp；
[0050]
组2：一轮pcr：ge-c-jjf/ge-d-jjr 700bp，二轮pcr:ge-cc-jjf/ge-cd-jjr 600bp；空载体：1100bp；
[0051]
组3：一轮pcr：ge-e-jjf/ge-f-jjr 1400bp，二轮pcr:ge-ce-jjf/ge-cf-jjr 1300bp；空载体：3500bp；
[0052]
组4：一轮pcr：ge-c-jjf/ge-d-jjr 1400bp，二轮pcr:ge-cc-jjf/ge-cd-jjr 1300bp；空载体：3500bp；
[0053]
巢式pcr后进行凝胶电泳检测，每组24个样本。发现组1和组2均为空载体；组2有19个阳性结果，其中15个为双带结果，4个为单带结果；组4有21个阳性结果，其中16个为双带结果，5个为单带结果。做进一步验证试验：重复转化pam1 4μl、pdonor1 1μl；重复转化pam1 4μl、pdonor3 1μl；转化pam1 4μl、pdonor1 2μl；转化pam1 4μl、pdonor1 4μl；转化pam2 4μl、pdonor2 1μl；转化pam2 4μl、pdonor4 1μl；进行凝胶电泳后分析可知：ptarget-f质粒和pcas质粒与含有敲除目的基因两端同源序列的pdonor的pcr产物片段一起共同作用，将所要敲除的目的基因序列敲除，并且敲入所需装入的目的基因。
[0054]
将验证后的菌体通过摇含iptg的培养基以去除ptarget-f质粒和摇37℃以去除pcas质粒，得到改良型大肠杆菌。
[0055]
实施例2
[0056]
步骤一：在pubmed数据库中查找taq dna聚合酶的dna合成活性结构域、t4 dna连接酶连接活性结构域和thermus aquaticus连接酶的连接活性结构域的dna序列，将三者用柔性linker线性连接，并在其n端和c端分别引入酶切位点ndei和xhoi，合成获得重组序列。该重组序列的序列如下所示：
[0057]
[0058]
[0059]
[0060][0061]
[0062]
步骤二：将上述重组序列合成并插入表达载体pet-22b(+)中，获得重组质粒，再将重组质粒转化进大肠杆菌克隆菌株dh5α中。
[0063]
步骤三：挑取含重组质粒的dh5α单克隆菌株，接种至lb培养基中培养，离心、收集菌体，然后加入浓度为300mg/ml的溶菌酶在冰浴条件下裂解30min，超声破碎，离心，纯化，洗脱并收集纯化后的蛋白，得到该聚合酶。
[0064]
实施例3
[0065]
极速基因合成方法包括如下步骤：
[0066]
步骤一：通过dnaworks程序设计寡核苷酸序列，然后合成寡核苷酸，通过重叠延伸pcr技术组装这些寡核苷酸，再加入引物、和聚合酶等进行第二轮pcr，对最终的pcr产物进行分析和纯化，得到纯化的dna片段，将纯化后的dna片段克隆进puc19载体，转化大肠杆菌后挑选单克隆菌落并进行菌落pcr，抽提质粒进行测序验证；通过荧光定量pcr测定质粒的拷贝数为1200，较常规基因合成方法提高了2倍。
[0067]
步骤二：将抽提的质粒纯化，纯化后的质粒采用基因测序技术对克隆产物进行验证，对比是否有突变、snps、插入或缺失，进行qc酶切验证后完成基因合成，该基因合成方法整套流程所用时间为3天。
[0068]
需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0069]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。