一株具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌及其在植物病害生物防控中的应用。


背景技术：

2.植物病害是制约农作物优质高产的重要因素之一，据统计全球主要农作物的病害损失约占作物总产量的20％～40％，每年直接经济损失高达数十亿美元。加之我国是农业生产大国，在农作物生长过程中病原菌的侵染严重影响了我国农业生产的健康发展。植物病原菌种类复杂多样，引起的病害也多种多样，每种作物几乎都有几种甚至几十种病害，大量施用化学药剂使一些病原菌产生抗药性，与此同时，也会带来农药残留、环境污染等一系列问题。生物防治是一种利用有益微生物及其代谢产物等对植物病虫害进行防治的措施，因具有对环境无污染、对人畜安全、产品无残留、对病原菌特异性强等优点越来越受到重视，但目前我国可用于生产实践的微生物制剂产品较少、防治机制单一、在实际应用中面临复杂的田间环境效果不稳定。因此，亟需发展更高效低毒、安全绿色的病害防控策略。
3.芽孢杆菌具有抗菌谱广、生长繁殖快、抗逆性强、易分离培养、生物安全性高等诸多优点，在农业、医药、食品等领域已被广泛研究。贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)是近十年来新发现的一种具有广谱的抑菌活性的细菌，能够产生多种对病原菌具有拮抗作用的次生代谢产物及对病原菌具有裂解活性的胞外酶；同时作为生防菌中最具生防应用价值的拮抗菌之一，贝莱斯芽孢杆菌在植物病害防治方面具有显著的优点。针对某一种或几种植物病害，定向分离具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌，对其抑菌潜力进行深入挖掘，再将其应用于植物病害的防治，具有重要的现实意义，同时也有利于推进我们绿色农业的可持续发展进程。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供了一株对多种植物病原菌具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)rc116，其于2022年5月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为中国广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编：510070，保藏号为：gdmcc no：62500。
5.本发明的第二个目的是提供上述贝莱斯芽孢杆菌rc116在以下任一方面的应用。
6.(1)植物病害的生物防治；
7.(2)制备抑制植物病原菌的药物；
8.(3)制备生物肥料添加剂；
9.优选，所述的植物病原菌为植物病真菌或细菌，例如茄科劳尔氏菌、丁香假单胞菌、野油菜黄单胞菌、番茄枯萎病菌、香蕉枯萎病菌和香蕉盘长孢菌的一种或多种。
10.本发明的第三个目的是提供一种微生物生防制剂或生物肥料添加剂，以本发明的贝莱斯芽孢杆菌rc116或其发酵液作为活性成分。
11.本发明的第四个目的是提供上述贝莱斯芽孢杆菌rc116在产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、对番茄青枯病菌和番茄枯萎病菌具有裂解活性的胞外粗蛋白中的应用。
12.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13.(1)贝莱斯芽孢杆菌rc116对6种植物病原菌具有很高的抑菌活性，其抑菌活性具有广谱性，可以用于植物病害的生物防治，尤其是番茄土传病害的生物防治。
14.(2)本发明的贝莱斯芽孢杆菌rc116能够产生大量的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶，其胞外粗蛋白对番茄青枯病菌和番茄枯萎病菌具有良好的裂解活性，这与以往的芽孢杆菌通过分泌次级代谢产物抑菌不同。
15.(3)本发明的贝莱斯芽孢杆菌还能够通过产生铁载体、分泌iaa及溶解土壤中难溶性的有机磷来促进番茄的生长，在生物肥料添加剂中具有广阔的应用前景。
16.bacillus velezensis rc116，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2022年5月31日，保藏编号为gdmcc no：62500。
附图说明：
17.图1为菌株rc116的形态特征。
18.图2为菌株rc116的进化特征分析。
19.图3为菌株rc116对植物病原细菌的平板抑菌活性。
20.图4为菌株rc116对植物病原真菌的平板抑菌活性。
21.图5为盆栽试验中菌株rc116对番茄青枯病的生防效果。
22.图6为盆栽试验中菌株rc116对番茄的促生效果。
23.图7为菌株rc116产酶、铁载体及iaa的能力测定结果。
24.图8为菌株rc116溶解有机磷产生的透明圈。
25.图9为菌株rc116胞外粗蛋白对茄科劳尔氏菌的裂解活性，tm表示在tm固体平板上的实验结果，na表示在na固体平板上的实验结果。
26.图10为菌株rc116胞外粗蛋白对番茄枯萎病菌的抑制活性。
具体实施方式：
27.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。以下实施方式除特殊说明外，均为本领域常规试剂盒步骤。
28.实施例1：菌株rc116的分离与纯化
29.从华南农业大学农场番茄青枯病发病田中采集健康番茄的根际土壤，过2mm筛混匀土壤样品，在室温条件下自然风干，在风干的土壤中种植“新金丰1号”番茄以活化土壤中的细菌，待番茄植株生长28d后，采集根际土壤样品进行细菌分离。具体方法为称取土壤样品10g于90ml无菌水中，180rpm震荡30min，后采用10倍梯度逐级稀释土壤溶液为10-1
～10-5
，分别取不同梯度的菌悬液100μl涂布于含1％青枯菌gmi1000的r2a平板上。30℃培养2d后挑取产生透明圈的菌株转接至r2a培养基上进行分离纯化，从而最终分离获得菌株rc116。
30.r2a固体培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，无水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，琼脂15.0g，蒸馏水
1000ml，ph 7.2
±
0.2，将各成分混合均匀，调整ph，121℃灭菌20min备用。
31.实施例2生防菌株rc116的分类鉴定
32.2.1表型特征及生理生化特征分析
33.菌株rc116在r2a平板上30℃培养2d，菌落为乳白色，不透明，菌落圆形或规则，边缘整齐(图1a)，革兰氏染色结果为阳性，透射电镜观察，该菌株细胞为杆状，有周生鞭毛，大小为1.6-1.8μm
×
0.7-0.8μm(图1c)。采用api 20ne和api zym试剂条进行测定硝酸盐还原、吲哚产生、水解明胶、精氨酸双水解酶等生理生化指标测试，结果表明no3-还原、β-葡萄糖苷酶、水解明胶、d-葡萄糖同化、l-阿拉伯糖同化、d-甘露糖同化、d-甘露醇同化、n-乙酰葡萄糖胺同化、d-麦芽糖同化、苹果酸同化和柠檬酸三钠同化为阳性，脲酶、葡萄糖酸钾同化、己二酸同化和苯乙酸同化为弱阳性，no2-还原、吲哚产生、d-葡萄糖发酵、精氨酸双水解酶和羊蜡酸同化为阴性。碱性磷酸盐酶、酯酶(c4)、类脂酯酶(c8)、类脂酶(c14)、酸性磷酸酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、α-葡萄糖甙酶和β-葡萄糖甙酶为阳性，白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖甙酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、n-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶和β-岩藻糖甙酶为阴性(表1)。
34.表1菌株rc116的表型特征
35.[0036][0037]
2.2系统进化分析
[0038]
通过水煮法提取菌株rc116的dna，利用细菌的16s rdna特异性引物27f(5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
)和1492r(5
′‑
tacgacttaaccccaatcgc-3
′
)和taq酶对rc116的16s rdna基因序列进行扩增，扩增产物经电泳分析产生约1500b左右的条带，切胶回收该条带后送苏州金唯智生物科技有限公司进行sanger测序，测序得到的序列经seqman软件拼接后获得16s rdna序列，提交至ezbioclode网站(https://www.ezbiocloud.net/)进行鉴定。采用mega 10软件构建基于16s rrna序列的neighbor joining系统发育进化树，计算模型为kimura 2-paremeter。通过sanger测序获得的菌株rc116的16s rrna基因的全长分别为1433bp(seq id no.1)。序列比对发现菌株rc116与已发表的bacillus siamensis kctc 13613的相似度为99.930％，与bacillus velezensis cr-502的相似度为99.928％。基于16s rrna基因序列构建的nj进化树显示，菌株rc116与bacillus siamensis kctc 13613和bacillus velezensis cr-502具有最近的亲缘关系(图2)。综上，根据16s rdna序列和形态特征结果，菌株rc116为芽孢杆菌属的细菌，但其与暹罗芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌的分离地位还需要进一步验证。
[0039]
seq id no.1
[0040]
aggttacctcaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcctg
[0041]
2.3比较基因组学分析：
[0042]
菌株rc116的基因组dna采用细菌基因组dna提取试剂盒(magen)进行提取，后经16s rrna基因扩增验证后由上海美吉生物科技有限公司完成基因组测序，双端文库构建和
illumina hiseq 2500测序均委托该公司完成。下机数据利用spades(3.13.0)软件进行基因组序列拼接组装。从ncbi数据库中下载拟用于比较分析的已发表的模式种的基因组序列，基于基因组序列利用fastani计算各菌株的平均核苷酸一致性(ani)。菌株rc116的基因组大小为4.02mb，gc含量分别46.5mol％。基于基因组的进化树分析结果显示菌株rc116与贝莱斯芽孢杆菌的亲缘关系最近(图2b)，此外，序列分析结果显示菌株rc116与16s rrna基因进化树中亲缘关系最近的bacillus siamensis kctc 13613和bacillus velezensis cr-502的之间的ani值分别为94％和99％(图2c)。这些结果表明菌株rc116属于贝莱斯芽孢杆菌。本发明将菌株rc116命名为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)rc116，于2022年5月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编为：510070，其保藏号为：gdmcc no：62500。
[0043]
实施例3：菌株rc116对植物病原菌的抑菌活性研究
[0044]
3.1菌株rc116对植物病原细菌的抑菌活性测定
[0045]
采用牛津杯双重培养法测定菌株rc116对三株植物病原细菌的拮抗活性。事先用牛津杯制作带孔的na固体平板。然后取在tm液体培养基(ttc培养基不含2,3,5-氯化三苯基四氮唑)中培养好的番茄青枯菌gmi1000菌液和在nb液体培养基(na培养基不含琼脂)中培养好的丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌菌液各20μl(od
600
＝1)分别涂布于带孔的na平板上。最后，在每孔中分别加入100μl nb培养基(阴性对照)和100μl庆大霉素(阳性对照)以及100μl nb在培养基中培养2d的菌株rc116(od
600
＝1)的菌液。将平板小心置于30℃培养箱中孵育培养48h。根据抑菌圈大小评价拮抗活性。平板实验重复三次。结果表明菌株rc116对3株供试的植物病原细菌均具有较好的抑菌活性，其中对丁香假单胞菌的抑菌活性最高，其次为番茄青枯病菌和野油菜黄单胞菌(图3)。
[0046]
na(营养肉汤)固体平板：蛋白胨10.0g/l，牛肉膏粉3.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15g/l，ph 7.0。
[0047]
3.2菌株rc116对植物病原真菌的抑菌活性测定
[0048]
采用平板对峙试验评估菌株rc116对三株植物病原真菌的拮抗活性。首先将三株植物病原真菌接种于pda平板(马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l)上，置于在28℃培养箱中培养7d。用直径为5mm的打孔器打真菌菌丝块，放置于新的pda平板(9cm)的中心，30℃培养1d。然后，取在nb培养基中生长2d的5μl菌株rc116培养液(od
600
＝1)接种到pda平板上距植物病原真菌中心2.5cm的位置，对照组取5μl nb培养基接种到pda平板上距植物病原真菌中心2.5cm的位置。30℃培养3d后，通过测量植物病原真菌的直径来观察拮抗活性。实验重复三次。结果表明，菌株rc116具有显著的抗真菌活性，在平板上能够明显抑制香蕉枯萎病菌、番茄枯萎病菌和香蕉炭疽病菌的生长(图4)，其中对番茄枯萎病菌的抑菌活性最强。综合上述结果，表明菌株rc116对植物病原真菌和细菌具有广谱抗菌活性，有望成为一种有前途的生物防治剂。
[0049]
实施例4：菌株rc116对番茄青枯病的生防效果评价及促生能力测定
[0050]
4.1茄科劳尔氏菌gmi 1000悬液的制备
[0051]
将菌株gmi 1000活化复苏后，在ttc固体培养基(上划线接种并置于30℃恒温培养箱培养。挑取单菌落接种于tm液体培养基中，置于30℃、180rpm摇床培养36h，室温6000g离心10min收集菌体，用灭菌水清洗2次以去除残留的培养基，然后用适量的无菌水重悬菌体
制备成菌悬液并利用血球计数板计数。
[0052]
ttc固体培养基：细菌学蛋白胨10.0g、酸水解酪蛋白1.0g、葡萄糖5.0g、2,3,5-氯化三苯基四氮唑0.5g、琼脂粉15.0g，用蒸馏水溶解并定容至1l，ph 7.2。配制好后115℃高温蒸汽灭菌20min，倒板。
[0053]
4.2贝莱斯芽孢杆菌rc116菌悬液的制备
[0054]
将菌株rc116甘油菌在r2a平板上活化复苏后，挑取单菌落接种于nb液体培养基中，在30℃、180rpm摇床震荡培养48h后，室温6000g离心10min收集菌体，用灭菌水清洗2次以去除残留的培养基，然后用适量的无菌水重悬菌体制备成菌悬液并利用血球计数板计数。
[0055]
4.3温室接种试验
[0056]
采集常年种植番茄的大田土壤用于盆栽试验，将采集的土壤风干处理，然后过2mm筛，室温存放备用。选择易感病番茄“新金丰1号”作为供试植物材料，番茄植株在湿度为80％，温度为28℃的温室大棚中生长，光暗周期为16h光照和8h黑暗。盆栽试验共设计4组：(1)接种无菌水的盆栽土作为对照(mock)；(2)盆栽土壤只接种gmi1000(1
×
107cfu/g土壤)；(3)盆栽土只接种菌株rc116(1
×
108cfu/g土壤)；(4)盆栽土壤同时接种茄科劳尔氏菌gmi 1000(1
×
107cfu/g土壤)和菌株rc116(1
×
108cfu/g土壤)。每盆中种植一株番茄，每个处理设置10盆，盆栽试验重复5次。接种时选取长势一致、高约15cm的番茄植株进行，接种方法采用伤根浸菌液加菌悬液灌根的方法，即先清洗干净番茄根部的泥土，然后将根在事先制备好的菌悬液中浸泡30min，然后栽回花盆中，每盆再灌入20ml菌液。移栽后放置于玻璃大棚中培养14d。如kempe发表的论文所述，每天观察并记录番茄幼苗的病害严重程度，计算各处理的发病率与病情指数。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌rc116对番茄青枯病具有良好的生防效果，在接种后21d，植株发病率下降为28％，病情指数为19，相对生防效率高达81％(图5)。
[0057]
菌株rc116对番茄的促生试验，接种方法同上，接种后28d统计番茄株高、地上部分和根鲜重、根长，促生试验重复三次。试验结果显示，菌株rc116对番茄具有明显的促生作用，接种后28d，菌株rc116处理组的番茄植株显著高于无菌水模拟接种处理的对照组的番茄(图6)。
[0058]
实施例5：菌株rc116产酶、产铁载体、iaa及溶磷能力测定
[0059]
5.1菌株产酶能力测定
[0060]
菌株rc116产蛋白酶含量测定方法为：配制含有2mm cacl2和1％酪蛋白的100mm tris缓冲液，并调节其ph 8.0。将含有50μlb.velezensis rc116上清液和950μl tris缓冲液的反应混合物在60℃下孵育15min。然后，加入500μl 20％三氯乙酸终止反应。将混合物离心15分钟以去除沉淀物，并使用紫外分光光度计在280nm处测量含有酸溶性蛋白质的上清液的吸光度。一个蛋白酶活性单位定义为每分钟释放1μg酪氨酸的酶量。菌株rc116产淀粉酶和脂肪酶含量测定采用南京建成生物工程所研发的试剂盒进行，其中淀粉酶含量测试盒的货号为c016-1-1，脂肪酶含量测试盒的货号为a054-1-1。结果表明，菌株rc116具有较强的产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的能力(图7a-7c)，其中培养3d时产蛋白酶的含量最高(图7a)，培养1.5d时产淀粉酶的含量最高(图7b)，培养2d时产脂肪酶的含量最高(图7c)。
[0061]
5.2菌株rc116产铁载体和iaa能力测定
[0062]
采用含有l-色氨酸(100mg/ml)的r2a液体培养基测定菌株产iaa的含量，具体方法为将菌株rc116接种于含有l-色氨酸(100mg/ml)的r2a液体培养基，28℃，180rpm摇床培养2d。取1ml培养好的菌液于ep管中10000rpm离心5min，取50μl上清于96孔板中，同时加入50μl salkowski比色液(50ml 35％的hclo4+1ml 0.5m fecl3)。将加入50μl 50mg/l iaa的比色液作为阳性对照。96孔板于室温避光放置30min后用酶标仪测地od530的吸光值，以梯度稀释的50mg/l的iaa作为标准品制作标准曲线，最后根据标准曲线方程计算菌株产iaa的含量。
[0063]
铁载体测定方法为取1ml培养好的rc116菌液于ep管中，12000rpm离心5min，取100μl上清于96孔板中，加入等体积的cas检测液混合均匀，静置1h后用酶标仪测定630nm波长吸光值as，以加ddh2o为对照调0，另取等体积未接种的灭菌r2a培养基与等体积的cas检测液混合，测定的吸光值为参比值ar。最后根据公式计算产生的铁载体量。产生的铁载体量(％)＝(ar-as)/ar*100。计算结果小于10％则认为是铁载体分泌为阴性。
[0064]
贝莱斯芽孢杆菌rc116定量产iaa和铁载体的结果见图7d和图7e，可以看出随着培养时间的延长，菌株rc116产iaa的含量是逐渐增加的，其中在培养5d的时候产iaa的含量最高，为38.21mg/l(图7d)。此外，随着培养时间的延长，菌株rc116产铁载体的能力也是逐渐增强的，在培养6d的时候最高可达64％(图7e)。
[0065]
5.3菌株rc116溶磷能力测定
[0066]
在r2a固体平板上活化菌株rc116甘油菌，30℃培养1d，刮取适量菌体接种在以卵磷脂为有机磷源的nbrip固体培养基中，30℃，培养2d，观察是否产生溶磷的透明圈。本实验的结果见图8，可以看到有明显的的透明圈产生，表明菌株rc116具有溶解有机磷的能力。
[0067]
nbrip固体培养基(卵磷脂为有机磷)：葡萄糖10g/l，卵磷脂5g/l，mgcl2·
6h2o 5g/l，mgso4·
7h2o 0.25g/l，kcl 0.2g/l，(nh4)2so
4 0.1g/l，琼脂15g，ph 7.0。
[0068]
实施例6：菌株rc116胞外粗蛋白对番茄青枯病菌和番茄枯萎病菌的裂解活性研究
[0069]
鉴于菌株rc116是从番茄根际土壤中分离到的，而番茄枯萎病和番茄青枯病又是番茄上的两大毁灭性的土传病害，所以我们进一步测定了菌株rc116的胞外粗蛋白对番茄枯萎病菌和番茄青枯病菌的裂解活性。具体实验方法如下：
[0070]
6.1硫酸铵沉淀法提取菌株rc116的胞外粗蛋白
[0071]
将菌株rc116接种于r2a固体平板上培养1d后，挑取单菌落接种于100ml na液体培养基中，置于30℃、180rpm摇床培养2d，然后以20000g冷冻离心20min收集发酵上清液。按照0～40％、40％～60％、60％～80％、80％～100％的硫酸铵饱和梯度依次对菌株rc116发酵上清液进行分级沉淀。取100ml发酵上清液置于烧杯中，放置在磁力搅拌器上，参照硫酸铵饱和梯度表，向发酵上清液中依次缓慢加入相应的硫酸铵粉末。在低温条件下(9℃)用磁力搅拌器搅拌3h后，以4℃、20,000g条件下冷冻离心，收集发酵上清液中析出的蛋白沉淀。各级沉淀蛋白组分以适量的pbs(10mm，ph7.2～7.4)缓冲液重悬。将获得的蛋白溶液转移至3.5kda分子量的透析袋中，使用大量的预冷的pbs缓冲液做透析液，透析16-24h，期间更换4次透析液，以彻底除去残留的硫酸铵。透析后冷冻离心收集透析袋内的溶液，去除变性的杂蛋白，再使用3.5kda分子量的超滤管，浓缩透析袋内溶液中溶解的蛋白，使蛋白质浓度为1mg/ml，制备成粗蛋白。将获得的粗蛋白分装于1.5ml ep管，置于-80℃冰箱保存备用。
[0072]
6.2菌株rc116胞外粗蛋白对番茄青枯病菌和番茄枯萎病菌的裂解活性测定
[0073]
菌株rc116胞外粗蛋白对番茄青枯病菌的裂解活性测定采用滤纸片法，即取灭菌的滤纸片置于事先制好的tm固体平板和na固体平板上，每个平板放置4个滤纸片，然后在滤纸片上滴加50μl 1mg/ml的不同饱和度硫酸铵沉淀的粗蛋白，将平板置于30℃培养3d后，观察各粗蛋白对番茄青枯病菌的裂解活性，实验重复三次。
[0074]
菌株rc116胞外粗蛋白对番茄枯萎病菌的裂解活性测定采用牛津杯法，即事先制作带孔的pda固体平板，然后在孔中加入50μl 1mg/ml的不同饱和度硫酸铵沉淀的粗蛋白。将平板置于30℃培养3d后，观察各粗蛋白对番茄枯萎病菌的抑制活性，实验重复三次。结果表明，不同饱和度硫酸铵沉淀的蛋白对番茄青枯病菌和番茄枯萎病菌均具有裂解活性，其中40-60％饱和度硫酸铵沉淀的胞外粗蛋白的抑菌活性最强，其次为0-40％饱和度硫酸铵沉淀的胞外粗蛋白，60-80％和80-100％饱和度硫酸铵沉淀的胞外粗蛋白的抑菌活性相差不大(图9和图10)。