一种长粗吻海龙特征多肽及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术检测，具体涉及一种长粗吻海龙特征多肽及其应用和鉴别长粗吻海龙的方法。

背景技术：

1、海龙是我国重要的动物药材，具有温肾壮阳、散结消肿的功效，用药历史悠久，基原众多。中国药典中规定海龙药用基源为海龙科动物刁海龙solenognathus hardwickii(gray)、拟海龙syngnathoides biaculeatus(bloch)或尖海龙syngnathusa cuslinnaeus的干燥体。

2、海龙作为补益类药材，市场需求逐年增加，由于目前海龙未能有效的实现人工养殖，海龙野生资源日益减少，多有以其他品种混淆或以次充好。目前，中国药典中未收录的不同来源的海龙销售比例逐年增大，导致海龙药材市场流通混乱。长粗吻海龙由于捕捞量大，价格较低，是市场上常见的混为品种。作为个体完整的海龙药材，长粗吻海龙与刁海龙、拟海龙、舒氏海龙因性状差异较大易于区分，但是一旦进行打粉处理或加工成提取物后，则性状特征消失从而无法辨别。此外，长粗吻海龙与粗吻海龙、葛氏海镯鱼因性状相似，单纯从性状进行鉴别不易区分。

3、目前海龙的种类鉴别和质量控制方法主要有性状鉴定法、hplc指纹图谱法和分子生物学法。性状鉴定法一般要求海龙个体完整，且需要鉴定者具有丰富的经验，该方法存在一定的主观性；hplc指纹图谱法专属性较低；分子生物学法具有高专属性，但受限于样品中遗传物质保存的完好程度，对于海龙药酒、炮制品、提取物、虫蛀霉变以及多个个体混杂的样品，因提取dna困难而无法顺利实验。近年来，越来越多的方法和标准中使用特征肽段对天然药物进行鉴别或定量研究。各物种中所含的蛋白质存在个别位点氨基酸的差别，可用适当的蛋白酶将差异位点截取出来，作为具有标识意义的多肽段，即特征肽段。特征肽段的检测一般使用质谱手段，无需考虑蛋白质活性，制备方法简单且肽段性质较为稳定。现有的海龙鉴定的方法限制因素较多，无法在海龙粉末、炮制品、提取物等衍生制品中进行应用，海龙蛋白中的特征肽段，有潜力作为海龙物种鉴定的指标成分。目前，各数据库中均未收载长粗吻海龙相关蛋白序列信息，无法通过蛋白序列比对获得差异肽段，因此尚未有长粗吻海龙特征多肽的相关记载。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种长粗吻海龙特征多肽及其应用和鉴别长粗吻海龙的方法。本发明提供的特征多肽针对长粗吻海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于海龙药材种属鉴别，具体为长粗吻海龙的鉴别，具有良好的应用前景。

2、本发明提供了一种长粗吻海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列如seq idno.1所示。

3、本发明还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别长粗吻海龙中的应用。

4、优选的是，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：seq id no.1质荷比为m/z779.6→994.5的定量离子，质荷比为m/z 779.6→1095.6的定性离子。

5、本发明还提供了一种长粗吻海龙的鉴别方法，采用seq id no.1所示的特征多肽作为对照品。

6、本发明还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别长粗吻海龙的方法，包括以下步骤：

7、(1)供试品溶液的制备：将预处理的海龙提取液或预处理的海龙粉提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；

8、(2)对照品溶液的制备：以上述技术方案所述长粗吻海龙特征肽为对照品，加水溶解，得到对照品溶液；

9、(3)检测分析：利用三重四极杆质谱法进行检测分析；

10、所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。

11、优选的是，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液；

12、所述预处理的海龙粉提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙粉提取液；

13、优选的是，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。

14、优选的是，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。

15、优选的是，所述酶解的条件为37℃酶解2h。

16、优选的是，所述三重四极杆质谱法以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱：0～3min，5％a→8％a；流速为每分钟0.5ml。

17、优选的是，所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，seq id no.1选择质荷比m/z 779.6→994.5的定量离子，m/z 779.6→1095.6的定性离子作为检测离子对。

18、本发明提供了一种长粗吻海龙共有特征多肽。本发明提供的特征多肽作为长粗吻海龙鉴别的指标成分，可与其他物种的海龙进行区分，为开发长粗吻海龙及相关产品的鉴别方法奠定基础。具体的，本发明所述特征多肽具有以下有益效果：

19、(1)本发明通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来，采用质谱进行检测，操作简单快捷，测定结果稳定，不受海龙样品的形态和加工过程的干扰，填补了长粗吻海龙物种鉴别以及海龙制品中长粗吻海龙检测方法的空白；

20、(2)本发明提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考；

21、(3)本发明提供的特征多肽针对长粗吻海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于长粗吻海龙药材的鉴别，具有良好的应用前景。

技术特征：

1.一种长粗吻海龙特征多肽，其特征在于，所述特征多肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述特征多肽在鉴别长粗吻海龙中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：seq id no.1质荷比为m/z 779.6→994.5的定量离子，质荷比为m/z 779.6→1095.6的定性离子。

4.一种长粗吻海龙的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特征多肽作为对照品。

5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液；

7.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。

8.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％；所述酶解的条件为37℃酶解2h。

9.根据权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于，所述三重四极杆质谱法以0.1％甲酸乙腈为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱：0～3min，5％a→8％a；流速为每分钟0.5ml。

10.根据权利要求5或9所述的鉴别方法，其特征在于，所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，seq id no.1选择质荷比m/z 779.6→994.5的定量离子，m/z779.6→1095.6的定性离子作为检测离子对。

技术总结
本发明涉及一种长粗吻海龙特征多肽及其应用和鉴别长粗吻海龙的方法，属于生物技术检测技术领域。本发明提供了一种长粗吻海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明提供的特征多肽针对长粗吻海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于长粗吻海龙的鉴别，具有良好的应用前景。

技术研发人员：尹雪,焦阳,林永强,汪冰,崔伟亮,于雅萌,解盈盈,周倩倩,于凤蕊
受保护的技术使用者：山东省食品药品检验研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12